Name: visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage
Uploaded: 2015-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃ¢â‚¬â„¢s Cartilage at JoVE.

Författarna tackar Alex Schier för vänligt dela Zebrabow-M transgen linje, Geoffrey Burns för pDEST vektorn och Renee Ethier-Daigle för utmärkt hand om fisken anläggningen och linjer. FINANSIERING: Vi är tacksamma för generösa finansieringsstöd från NIDCR RO3DE024490 och Shriners Hospitals for Children (ECL) och postdoktorsutbildningsstipendier från Shriners Hospitals for Children (LR och YK).

Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) godkände alla moment i protokollnummer # 2010N000106. Detta är i enlighet med Föreningen för bedömning och ackreditering av Laboratory Animal Care International (AAALAC) riktlinjer. 1. Reagens och material Förberedelser <ol><li> Bered en liter 50X E3 embryo medium (se tabell 1) och förbereda ett L 1X E3 embryo medium (se tabell 2).</s...

<ol>
	<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis.">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10:+kaede+zebrafish+transgenic+model.">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10:+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).</li><li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li><li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+education+and+CPD:+are+you+being+served.">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Vieira, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).</li><li>Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat-Dachsous+Signaling+Coordinates+Cartilage+Differentiation+and+Polarity+during+Craniofacial+Development.">Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development.</a> PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).</li><li>Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia:+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence.">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li><li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cartilage+and+bone.">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li></ol>

Alcianblått och photoconvertible transgena linjer som beskrivits ovan kompletterar varandra för att definiera den komplicerade processen att brosk och ben utveckling. Dock har levande cellulär migration och organisation under organogenesen länge hypoteser och indirekt visat men aldrig visualiseras. Zebrabow-M transgen linje tillsammans med en brosk specifik Cre medger samtidig levande observation av alla dessa olika händelser som är involverade i ben- och broskbildning. Denna teknik gör det möjligt att studera u...

Kraniofaciala utveckling kräver komplexa molekylära, cellulära och vävnadsinteraktioner att driva celltillväxt, migration och differentiering 1,2, 3. Detta hårt reglerad och komplicerad process är föremål för genetiska och miljömässiga störningar, så att kraniofaciala missbildningar är bland de vanligaste födelse missbildningar 1-9. Även kirurgiska ingrepp förblir grunden för behandling av kraniofaciala anomalier, att förstå utvecklingen grunden är viktigt att förnya framtida terapier. Därför studera morfogenes och mekanismerna i konvergens och utbyggnad och integration cell ger nya insikter i bildandet av den kraniofaciala skelettet 1. Kraniell neurallisten migrera och fylla den första svalget bågen, sedan bilda parade mandibulära processer som sträcker sig för att bilda Meckels brosk, vilket förebådar underkäken. Morfogenes of Meckels brosk kräver kondrocyt organisationen via riktad spridning, cell polarisering och differentiering 1,10. Förblir dock intrikat av chondrocyte organisation i tillväxt och utvidgning av Meckels brosk oklar. Förstå dynamisk cellens beteende är avgörande för att förstå medfödda missbildningar som påverkar mandibular storlek, såsom hypoplastiska käken fenotyper 11. Zebrafisk embryon erbjuder många utvecklings- och genetiska fördelar för detaljerad studie av Meckels brosk morfogenes. Deras genetiska spårbarhet, öppenhet, ex vivo och snabb utveckling är kraftfulla fördelar utlåning det bra för observation av cellrörelse och organisation av levande avbildning 6. Använda linje-spårning verktyg, såsom sox10: kaede transgen linje, har vi och andra avgränsade neurallisten ursprung embryonala kraniofaciala skelettet 1,5. USIng sox10: ERT2-Cre med ubi: Zebrabow-M transgen linje, är det nu möjligt att utforska detaljer om cellulära rörelser under kraniofaciala utveckling. Den Zebrabow-M, är en transgen linje framtagen med ubiquitin-promotorn som driver uttrycket av olika fluoroforer, vardera flankeras av lox-ställen 8. Den Zebrabow-M standard fluorofor är röd, som uttrycker RFP. Efter induktion av Cre uttryck, den Zebrabow-M konstruera rekombinerar och celler uttrycker en kombination av olika fluoroforer (RFP, GFP och YFP) skapar multi-spektrala uttryck i embryot. Alla dotterceller som skiljer från de märkta cellerna efter rekombinationshändelsen sedan klonalt märkta, så att cellpopulationer som härrör från olika intill varandra belägna stamceller är klonalt märkta. Genom denna kloningscellmärkning, kan celler spridning och migration med klon upplösning följas (Figur 1 och 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Life Sciences</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare 500 &#956;L stock aliquots at 50mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (N-Phenylthiourea)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-HydoxyTamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 x 18 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 25 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR5&#39;-TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>K591-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR3&#39;-pA</td>
			<td>Tol2Kit</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Geoffrey Burns labs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage

Utveckling av ryggradsdjur kraniofaciala strukturer kräver noggrann samordning av cellmigration, proliferation, vidhäftning och differentiering. Mönstring av Meckels brosk, en första svalg båge derivat, innebär migration av hjärn neurallisten (CNC) celler och den progressiva partitione, spridning och organisation av differentierade kondrocyter. Flera studier har beskrivit CNC migration under underkäken morfogenes, men detaljerna i hur kondrocyterna uppnår organisation i tillväxt och utvidgning av Meckels brosk är fortfarande oklart. Den sox10 bundet och kemiskt inducerad Cre-rekombinas-förmedlad rekombination genererar permutationer av distinkta fluorescerande proteiner (RFP, YFP och GFP), och därigenom skapa en multispektral märkning av progenitorceller och deras avkomma, vilket återspeglar distinkta klonala populationer. Med hjälp av konfokal time-lapse fotografering, är det möjligt att observera kondrocytema behavieller under utveckling av zebrafisk Meckels brosk. Multispektrala cellmärkning gör det möjligt för forskarna att visa förlängning av Meckels kondrocyter. Under förlängningsfasen av Meckels brosk, vilket förebådar underkäken, kondrocyter inskjuta att åstadkomma utsträckning som de stack på ett organiserat encelliga lager rad. Misslyckande av detta organiserade interkalerande process för att förmedla cell förlängning ger den cellulära mekanistisk förklaring för hypoplastic käken som vi ser i underkäken missbildningar.

Traditionell brosk visualisering av hela mount alcianblått fläckar har varit ovärderligt att observera utvecklings Meckels brosk och som vanligen används för att visualisera slut cellulär organisation 12 (Figur 1A). För att ytterligare analysera utvecklings kondrocyter övertid, härstamning spårning med hjälp sox10: Kaede transgena linjer har gjort det möjligt för oss att studera cell migration, konvergens och förlängning i levande embryon 2,12 (Figur...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃ¢â‚¬â„¢s Cartilage at JoVE.

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Cell organisation av kraniofaciala ben har länge varit en hypotes men aldrig direkt visualiseras. Multi-spektral cellmärkning och in vivo levande avbildning möjliggör visualisering av dynamiska cellbeteende i zebrafisk käken. Här, att vi i detalj protokollet manipulera Zebrabow transgen fisk och direkt observera cell inlagring och morfologiska förändringar av kondrocyter i Meckels brosk.

Visualisering av kondrocyttransplantation interkalering och riktnings spridning via Zebrabow Kloncellanalys i embryonala Meckels Brosk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Analys av kranskärlen i clearade embryonala hjärtan

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC primärblottanalys som kvantifierar DNA-metyleringsnivån av kondrocyt-skillnad<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering av humaniserade benmärgsmiljöer i mus och deras visualisering genom Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonal analys av hematopoetiska stamceller från embryon prekursorer använder enstaka Cell Index sortering kombinerade med endotelceller nisch samtidig kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiella cellmigration i den framkallande Chick fiberoptiska Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Vitro analyser att utvärdera migreringen, Invasion och spridning av förevigade mänskliga första trimestern trofoblaster cellinjer

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Mikroskop-baserat System för i Vivo Implantation av embryonala hjärtmuskelcellerna i aviär embryot

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...