Name: selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification
Uploaded: 2015-08-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification at JoVE.com

This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

ملاحظة: تم عرض هذه الطريقة الموصوفة سابقا 56. 1. الببتيد الهدف اختيار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع قائمة من البروتينات المستهدفة، وتشمل عددا صغيرا من البروتينات التدبير المنزلي للتطبيع عبر العينات...

المطلق البروتين الكمي ضروري لمجموعة متنوعة جدا من التطبيقات الطبية الحيوية مثل التحقق من صحة العلامات البيولوجية ونقل الإشارة النمذجة الطريق. في الآونة الأخيرة، البروتينات المستهدفة باستخدام LC-SRM قد استفاد من التحسينات على تقنيات عديدة بما في ذلك إعداد الببتيد الق...

تجارب البروتين التي تستخدم الطيف الكتلي (MS) يمكن أن تكون مصممة لاستخدام إما غير المستهدفة (بندقية) أو الأساليب المستهدفة. البروتينات اكتشاف يعتمد عموما على بندقية من أسفل إلى أعلى MS، إما باستخدام طريقة الاستحواذ التي تعتمد على البيانات التقليدية، أو باستخدام واحدة من التقنيات بيانات مستقلة وضعت مؤخرا (على سبيل المثال، MS E، رقعة) 1،2. البروتينات البندقية هي أداة قوية لتحديد الببتيد الإنتاجية العالية وتقدير نسبي، ولكنه غير مناسب عموما لتقدير المطلق أو لاستهداف، ومجموعات صغيرة محددة (~ عشرات) من البروتينات. يتم تحديد طريقة MS غالبا ما تستخدم لالبروتينات المستهدفة رد فعل الرصد (SRM) لما له من حساسية عالية، وسرعة، ومجموعة ديناميكية 3-5. وتشمل بدائل لSRM رصد رد فعل مواز، الذي يستفيد من ذات الدقة العالية، والكامل MS مسح 6. SRM عادة ما يتم إجراء باستخدام rever النانو تدفقالمرحلة سد عالية الأداء اللوني السائل (نانو-RP-LC) أداة بالإضافة إلى تأين electrospray نانو (النانو ESI) مصدر أيون تعلق على الثلاثي رباعية مطياف الكتلة (QQQ-MS). في تجربة نموذجية، يتم هضم البروتينات proteolytically العينة، ويتم فصل الببتيدات الناتجة chromatographically، المستوعبة، والمتأينة. ينتج عن ذلك من أيونات السلائف هي م / ض تصفيتها من قبل رباعي الأول (Q1) ومجزأة في رباعي الثاني (Q2) عن طريق الاصطدام بها مع الغاز الاصطدام. الأيونات جزء الناتجة م / في رباعي الثالث (Q3) وكميا من قبل dynode التي تمت تصفيتها ض. ويشار إلى كل زوج السلائف وتفتيت أيون لكمرحلة انتقالية، ويتم رصد كل انتقال لفترة زمنية محددة (زمن السكون، عادة 2-50 مللي ثانية). خلال LC-SRM، دورات QQQ-MS من خلال قائمة محددة مسبقا من التحولات (دورة العمل هو عادة ≤3 ثانية)، وأنتجت اللوني من كل انتقال. الاستراتيجيه البديلةالمنشأ للبروتين الكمي وعادة ما تستخدم المناعية مثل نقطة البقع، البقع الغربية، ELISAs، ميكروأرس الأضداد، عكس المرحلة ميكروأرس البروتين، والمناعية ميكروفلويديك، ELISAs الرقمية، والمناعية على أساس microsphere 7. يمكن للأفضل المناعية يكون بشكل ملحوظ أكثر حساسية من LC-SRM، وعينة مرت من المناعية يمكن أن يكون أعلى بكثير من LC-SRM 5. ومع ذلك، يمكن أن تكون مكلفة المناعية تطوير و / أو مضيعة للوقت، ويمكن للفحوصات الناتجة تكون عرضة لعبر التفاعل و / أو تدخل، تتعارض مع خلية / تحلل الأنسجة / طرق التجانس، و / أو غير قابلة للمضاعفة 5،8. بعض من هذه القضايا يمكن معالجتها من خلال اقتران تقنيات الأضداد ومقرها MS. على سبيل المثال، والبروتينات المستهدفة يمكن إثراء باستخدام مناعي قبل التحلل البروتيني وLC-SRM 12/09. بدلا من ذلك، تقنية SISCAPA توظف مناعي لاحقا إلى التحلل البروتيني في LEVE الببتيدل 13،14. بالإضافة إلى immunoenrichment استراتيجيات، يمكن استخدامها immunodepletion من البروتينات وفرة عالية لزيادة حساسية LC-SRM عن طريق الحد من تدخل coeluting التحاليل 15،16. ويمكن تقسيم يستند إلى MS-البروتين الكمي في الكمي النسبي والمطلق، وأيضا في وضع العلامات النظائر مستقرة وخالية من التسمية (على سبيل المثال، ووضع العلامات الأيضية، ووضع العلامات الكيميائية، والبروتين الثقيل وصفت والببتيد المعايير الداخلية). يمكن أن تقنيات خالية من التسمية أن تكون مفيدة للالنسبي البروتين الكمي، ولكن من غير مناسب لتقدير المطلق دقيقة. وعلى سبيل المقارنة، خفضت تقنيات الوسم الخطأ المرتبط إعداد العينات وMS التباين، وغالبا ما تستخدم للبروتين النسبي الكمي 17. على سبيل المثال، أعدت مستقر النظائر المسمى بروتيوم (SILAP) المعايير باستخدام خط الخلية البشرية مثقف تمكين الكمي النسبي من المؤشرات الحيوية المحتملة عن طريق LC-SRM من المصل البشري 18. دقيقة الكمي البروتين المطلق MS يتطلب أن النقى كميا، البروتين المسمى isotopically أو الببتيد المعايير الداخلية أن ارتفعت-في العينات البيولوجية قبل MS. إدراج النظائر الثقيلة المعايير الداخلية وصفت في سير عمل LC-SRM تمكن الكمي المطلق الذي ثبت أن تكون استنساخه للغاية وقابلة للتحويل بين المختبرات 16،19. وتشمل النظائر المستقرة المعايير الداخلية وصفت لتقدير البروتين المطلق MS أعدت معايير الببتيد باستخدام التوليف الصلبة مرحلة 20 والبروتينات تتكون من متسلسلة معايير الببتيد البروتيني شطورة 21، والمعايير بروتين كامل طول 22. هدف التعديل البروتين التساهمية وإعداد نموذج غير مكتمل (أي غير مكتمل عينة تحلل والتجانس، وناقصة البروتين الإذابة، تمسخ، الألكلة، والتحلل البروتيني) يمكن أن تقوض التقدير الدقيق. ص الداخليهي المعايير rotein الأقل احتمالا أن تتأثر معظم هذه المشاكل المحتملة، ولكنها عادة ما تكون الأكثر صعوبة للاستعداد. بديل هو تحليل كل بروتين الهدف باستخدام معايير متعددة الببتيد الداخلية التي صممت لتشمل مواطني المرافقة بقايا جذر الأمينو وكربوكسي المحطة. بغض النظر عن التي يعمل نوع من معيار الداخلية، ينبغي أن ارتفعت-في العينات البيولوجية في أبكر وقت خلال إعداد عينة وقت ممكن. أيضا، يجب اختبار تقنيات إعداد عينة متعددة (على سبيل المثال، وظروف تمسخ مختلفة). استخدام أساليب فنية تجريبية متعامدة متعددة (تجريبي عبر التحقق من صحة) هو استراتيجية قابلة للتطبيق للتغلب على معظم الكمي المحتمل التحديات 23-25. LC-SRM الكمي من البروتينات هي تقنية مرنة للغاية والتي تم استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات. والجدير بالذكر، وقد تم استخدامه لدراسة الببتيد وبروتين المؤشرات الحيوية داخلالعينات السريرية مثل مصل، الخزعات الأساسية، وشفاطات إبرة دقيقة 5. كما تم استخدام LC-SRM لقياس رياضيات الكيمياء من المجمعات بروتين 5،26، للكشف عن أعصاب البوتولينوم 27، لتحديد ديناميات البروتين الفسفرة ضمن مسارات إشارات 5، وتحديد التغيرات في التشكل البروتين 28. مختبرنا يستخدم LC-SRM لتحديد البروتينات مما يشير إلى أن توسط الكيميائي البلاعم لدعم تطوير المحاكاة المسار الكيميائي. الخطة الشاملة للبروتوكول (الشكل 1) يبدأ مع مرتبة الببتيدات المستهدفة مؤقتة. وفي وقت لاحق، وقد تم تجميع معايير الببتيد الخارجية الخام واستخدامها لتطوير المقايسات LC-SRM للتحاليل نوعية العينات البيولوجية. إذا تم اكتشاف البيولوجي المستمدة من عينة الببتيد الهدف، تم إعداد معايير الببتيد الداخلية الثقيلة المسمى النقاء لالكمي LC-SRM. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لميلانcurately تحديد البروتينات من مجموعة واسعة من العينات البيولوجية، ودعم التحقيقات في طائفة واسعة من الأهداف البروتين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture EDTA, 500mM, pH8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 disposable counting chambers</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, LC-MS grade, ampules</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-10X1AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>0640030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M, pH 7.2</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3028-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Magic C18AQ, 5&#181;m, 200&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM5/61200/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Halo ES-C18, 2.7&#181;m, 160&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM3/93100/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC coated silica capillary, 50&#181;m id</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>200-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>500-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase, from Photinus pyralis</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9506-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>516481-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>9586-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04906837001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT023590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SPD111V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube decapper for Micronic tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1765-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

تطوير نماذج حسابية التنبؤية للإشارة مسارات نقل هو واحد من الأهداف الأساسية للبيولوجيا الأنظمة 53. للأسف، حتى بالنسبة لمسارات الإشارات التي تم دراستها على نطاق واسع ولها أهمية سريرية عالية، فإنه لا يزال لا عموما من الممكن التنبؤ كميا سلوك الطريق ردا على الاضطرا...

Watch this Scientific Journal Video about Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification at JoVE.com

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

رد الفعل المحدد رصد الطيف الكتلي لالمطلق البروتين الكمي

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

تي موجة ايون التنقل الكتلة الطيفي : الإجراءات التجريبية الأساسية لتحليل البروتين مجمع

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

التنميط بروتيوم الأكسدة والاختزال ثيول استخدام الطيف النظائر كتلة توصيف

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس<sup&gt; 15</sup&gt; N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

الجمع بين المواد الكيميائية العابرة للربط والطيف الكتلي لمجمعات البروتين سليمة لدراسة الهندسة المعمارية لتجميعات فرعية متعددة البروتين

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...