Name: selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification
Uploaded: 2015-08-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification at JoVE.com

This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

नोट: इस विधि में पहले 56 में वर्णित किया गया है। 1. पेप्टाइड लक्ष्य के चयन <ol><li> लक्ष्य प्रोटीन की एक सूची संकलित करें, और जैविक नमूने भर में सामान्य बनाने के लिए गृह व्यवस्था प्रोटीन की एक छो?...

निरपेक्ष प्रोटीन मात्रा का ठहराव ऐसे बायोमार्कर सत्यापन और संकेत पारगमन मार्ग मॉडलिंग के रूप में जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों का एक बहुत ही विविध रेंज के लिए आवश्यक है। हाल ही में, नियंत्रण रेखा के आर एम ?...

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग करने वाले प्रोटिओमिक प्रयोगों गैर लक्षित (बन्दूक) या लक्षित तरीकों का भी उपयोग करने के लिए तैयार किया जा सकता है। डिस्कवरी प्रोटिओमिक्स आम तौर पर एक पारंपरिक डेटा पर निर्भर अधिग्रहण मोड का उपयोग कर, या (उदाहरण के लिए, एमएस ई, पट्टी) हाल ही में विकसित डेटा स्वतंत्र तकनीकों में से एक 1,2 का उपयोग करके, या तो नीचे-ऊपर बन्दूक एमएस पर निर्भर करता है। शॉटगन प्रोटिओमिक्स उच्च throughput पेप्टाइड पहचान और रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, लेकिन यह पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए या प्रोटीन के छोटे से परिभाषित सेट (~ दसियों) को लक्षित करने के लिए आम तौर पर अनुपयुक्त है। सबसे अधिक बार निशाना बनाया प्रोटिओमिक्स के लिए इस्तेमाल किया एमएस विधि क्योंकि इसकी उच्च संवेदनशीलता, गति, और गतिशील रेंज में 3-5 की प्रतिक्रिया की निगरानी (एस आर एम) का चयन किया गया है। एस आर एम के लिए वैकल्पिक उच्च संकल्प, पूर्ण एमएस स्कैनिंग 6 का लाभ लेता है जो समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी, ​​शामिल हैं। एस आर एम आमतौर पर एक नैनो प्रवाह लौ का उपयोग किया जाता हैSED चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (नैनो आरपी-नियंत्रण रेखा) एक नैनो electrospray आयनीकरण करने के लिए मिलकर साधन एक ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर (Qqq एमएस) से जुड़ी (नैनो ईएसआई) आयन स्रोत है। एक ठेठ प्रयोग में, नमूना प्रोटीन proteolytically पच जाता है, और जिसके परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स chromatographically अलग desorbed, और आयनित कर रहे हैं। जिसके परिणामस्वरूप अग्रदूत आयनों एम / पहला quadrupole (क्यू 1) द्वारा फ़िल्टर जेड और एक टक्कर गैस उन के साथ टकराने से दूसरे quadrupole (Q2) में खंडित कर रहे हैं। जिसके परिणामस्वरूप टुकड़ा आयनों हैं मी / z फ़िल्टर तीसरे quadrupole (Q3) में और एक dynode द्वारा मात्रा। प्रत्येक अग्रदूत और टुकड़ा आयन जोड़ी एक संक्रमण के रूप में जाना जाता है, और प्रत्येक संक्रमण एक निर्दिष्ट समय अवधि (समय ध्यान केन्द्रित करना, आम तौर पर 2-50 मिसे) के लिए नजर रखी है। नियंत्रण रेखा के आर एम के दौरान, संक्रमण के एक पूर्वनिर्धारित सूची के माध्यम से Qqq एमएस चक्र (कर्तव्य चक्र आम तौर पर ≤3 सेकंड है), और प्रत्येक संक्रमण के एक वर्णलेख उत्पादन किया जाता है। वैकल्पिक रणनीतिप्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए एँ आम तौर पर ऐसे डॉट दाग, पश्चिमी blots, ELISAs, एंटीबॉडी, रिवर्स चरण प्रोटीन, microfluidic immunoassays, डिजिटल ELISAs, और microsphere आधारित immunoassays के रूप में 7 immunoassays का उपयोग करें। सबसे अच्छा immunoassays नियंत्रण रेखा के आर एम की तुलना में काफी अधिक संवेदनशील हो सकता है, और immunoassays के throughput नमूना नियंत्रण रेखा के आर एम 5 की तुलना में काफी अधिक हो सकता है। हालांकि, विकासशील immunoassays महंगा हो सकता है और / या समय लेने वाली है, और जिसके परिणामस्वरूप assays के सेल / ऊतक सेल / homogenization के तरीकों के साथ असंगत, पार जेट और / या हस्तक्षेप करने के लिए असुरक्षित हो सकता है, और / या उत्तरदायी नहीं 5,8 बहुसंकेतन के लिए। इन मुद्दों में से कुछ antibody- और एमएस आधारित तकनीक युग्मन द्वारा संबोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लक्ष्य प्रोटीन पूर्व प्रोटियोलिसिस और नियंत्रण रेखा के आर एम 9-12 immunoprecipitation का उपयोग कर समृद्ध बनाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, SISCAPA तकनीक पेप्टाइड छुट्टी पर प्रोटियोलिसिस करने के बाद immunoprecipitation को रोजगारएल 13,14। इसके अलावा रणनीतियों immunoenrichment करने के लिए, उच्च बहुतायत प्रोटीन की immunodepletion analytes 15,16 coeluting द्वारा हस्तक्षेप को कम करने से नियंत्रण रेखा के आर एम संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए नियोजित किया जा सकता है। एमएस आधारित प्रोटीन मात्रा का ठहराव लेबल से मुक्त और स्थिर आइसोटोप लेबलिंग (उदाहरण के लिए, चयापचय लेबलिंग, लेबलिंग रासायनिक, और भारी लेबल प्रोटीन और पेप्टाइड आंतरिक मानकों) में भी सापेक्ष और निरपेक्ष मात्रा का ठहराव में विभाजित किया जा सकता है। लेबल मुक्त तकनीक सापेक्ष प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन सटीक पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए अनुपयुक्त हैं कर सकते हैं। तुलना करके, लेबलिंग तकनीक नमूना तैयार करने और एमएस विचरण के साथ जुड़े त्रुटि को कम कर दिया है, और अक्सर रिश्तेदार प्रोटीन मात्रा का ठहराव 17 के लिए उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, स्थिर आइसोटोप में लेबल के proteome (SILAP) मानकों मानव सीरम 18 वर्ष की नियंत्रण रेखा के आर एम के माध्यम से संभावित बायोमार्कर के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव सक्षम एक सुसंस्कृत मानव कोशिका लाइन का उपयोग कर तैयार। एमएस द्वारा सटीक निरपेक्ष प्रोटीन मात्रा का ठहराव शुद्ध, मात्रा निर्धारित, isotopically लेबल प्रोटीन या पेप्टाइड आंतरिक मानकों नुकीला-में किया है कि एमएस के लिए पहले जैविक नमूने की आवश्यकता है। एक नियंत्रण रेखा के आर एम कार्यप्रवाह में भारी आइसोटोप में लेबल आंतरिक मानकों का समावेश अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रयोगशालाओं 16,19 के बीच हस्तांतरणीय होना दिखाया गया है कि पूर्ण मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है। एमएस द्वारा पूर्ण प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए स्थिर आइसोटोप लेबल वाली आंतरिक मानकों पेप्टाइड मानकों ठोस चरण संश्लेषण 20, concatenated प्रोटीज-cleavable पेप्टाइड मानकों 21 से बना प्रोटीन, और पूर्ण लंबाई प्रोटीन मानकों में 22 का उपयोग कर तैयार शामिल हैं। लक्ष्य प्रोटीन सहसंयोजक संशोधन और अधूरा नमूना तैयार करने (यानी, अधूरा नमूना lysis और homogenization, और अधूरा प्रोटीन solubilization, विकृतीकरण, alkylation, और प्रोटियोलिसिस) सही मात्रा का ठहराव को कमजोर कर सकते हैं। आंतरिक पीrotein मानकों इन संभावित समस्याओं के अधिकांश से प्रभावित होने की कम से कम संभावना है, लेकिन वे आम तौर पर तैयार करने के लिए सबसे मुश्किल है। एक वैकल्पिक amino- और carboxy टर्मिनल देशी flanking अवशेष शामिल करने के लिए तैयार कर रहे हैं जो कई आंतरिक पेप्टाइड मानकों का उपयोग कर प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए है। भले ही आंतरिक मानक के प्रकार कार्यरत है, जिनमें से यह नुकीला-में किया जाना चाहिए जैविक नमूने के रूप में जल्दी एक बिंदु पर संभव के रूप में नमूना तैयार करने के दौरान। इसके अलावा, कई नमूना तैयार करने की तकनीक (उदाहरण के लिए, अलग विकृतीकरण शर्तें) परीक्षण किया जाना चाहिए। कई ओर्थोगोनल प्रयोगात्मक तकनीक (प्रयोगात्मक पार विधिमान्यकरण) के उपयोग को 23-25 ​​चुनौतियों के सबसे संभावित मात्रा का ठहराव पर काबू पाने के लिए एक व्यवहार्य रणनीति है। प्रोटीन की नियंत्रण रेखा के आर एम मात्रा का ठहराव आवेदनों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया गया है कि एक अत्यंत लचीला तकनीक है। विशेष रूप से, यह भीतर पेप्टाइड और प्रोटीन बायोमार्कर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैइस तरह के सीरम, कोर बायोप्सी, और ठीक सुई रेस्पायरेट्रस 5 के रूप में नैदानिक ​​नमूने हैं। नियंत्रण रेखा के आर एम भी, बोटुलिनम न्यूरोटोक्सिन 27 का पता लगाने के संकेत दे रास्ते 5 भीतर प्रोटीन फास्फारिलीकरण गतिशीलता यों, और प्रोटीन रचना 28 में परिवर्तन यों, प्रोटीन परिसरों 5,26 के stoichiometry को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हमारी प्रयोगशाला कीमोटैक्सिस मार्ग सिमुलेशन के विकास का समर्थन करने के लिए बृहतभक्षककोशिका कीमोटैक्सिस कि मध्यस्थता संकेत प्रोटीन यों के लिए नियंत्रण रेखा के आर एम उपयोग कर रहा है। प्रोटोकॉल की समग्र योजना (चित्रा 1) जांच का लक्ष्य पेप्टाइड्स रैंकिंग के साथ शुरू होता है। बाद में, कच्चे तेल की बाहरी पेप्टाइड मानकों संश्लेषित और जैविक नमूने के गुणात्मक विश्लेषण के लिए नियंत्रण रेखा के आर एम assays के विकसित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। जैविक नमूने व्युत्पन्न लक्ष्य पेप्टाइड का पता चला है, तो शुद्ध भारी लेबल आंतरिक पेप्टाइड मानकों मात्रात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम के लिए तैयार कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल एसी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैcurately जैविक नमूने की एक विस्तृत विविधता से प्रोटीन यों, और प्रोटीन लक्ष्यों की एक विस्तृत विविधता की जांच का समर्थन है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture EDTA, 500mM, pH8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 disposable counting chambers</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, LC-MS grade, ampules</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-10X1AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>0640030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M, pH 7.2</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3028-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Magic C18AQ, 5&#181;m, 200&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM5/61200/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Halo ES-C18, 2.7&#181;m, 160&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM3/93100/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC coated silica capillary, 50&#181;m id</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>200-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>500-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase, from Photinus pyralis</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9506-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>516481-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>9586-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04906837001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT023590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SPD111V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube decapper for Micronic tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1765-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

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Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

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