Name: selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification
Uploaded: 2015-08-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification at JoVE.com

This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

OBS: Denna metod har tidigare beskrivits 56. 1. Peptid målval <ol><li> Sammanställ en lista över de målproteiner, och inkluderar ett litet antal hushållning proteiner för normalisering över biologiska prover, och även inkludera en intern proteinstandard (t.ex. eldflugeluciferas). Smälta målproteiner i tryptiska peptider i silico med hjälp av ett verktyg, såsom proteindigestion Simulator 29,30. </li><li> Kräv att peptiderna är fullt tryp...

Absolut protein kvantifiering är en förutsättning för ett mycket varierat utbud av biomedicinska tillämpningar såsom validering biomarkörer och signaltransduktionsväg modellering. Nyligen har riktade proteomik använder LC-SRM gynnats av förbättringar för många teknologier däribland peptidstandardberedningen, HPLC, QQQ-MS och LC-SRM dataanalys. Följaktligen har det blivit ett kraftfullt alternativ till immunanalyser. Immun kan vara extremt känslig och hög genomströmning, men att utveckla en robust immun...

Proteomik experiment som använder masspektrometri (MS) kan utformas för att använda antingen icke öron (hagelgevär) eller riktade metoder. Discovery proteomik bygger i allmänhet på bottom-up hagelgevär MS, antingen genom att använda en traditionell databeroende förvärvsläge, eller med någon av de nyligen utvecklade dataoberoende teknik (t.ex. MS E, SWATH) 1,2. Shotgun proteomik är ett kraftfullt verktyg för hög genomströmning peptid identifiering och relativ kvantifiering, men det är i allmänhet olämpligt för absolut kvantifiering eller riktar sig till småföretag, definierade uppsättningar (~ TEN) av proteiner. MS metod som oftast används för riktade proteomik väljs reaktion övervakning (SRM) på grund av dess höga känslighet, hastighet och det dynamiska omfånget 3-5. Alternativ till SRM inkluderar parallella reaktionsövervakning, som drar nytta av hög upplösning, full MS skanning 6. SRM utförs vanligtvis med användning av en nanoflöde reverSED-fas HPLC (nano-RP-LC) instrument kopplat till en nano elektrosprayjonisering (nano ESI) jonkälla fäst till en trippel kvadrupol masspektrometer (QQQ-MS). I ett typiskt experiment, är provproteiner proteolytiskt digere, och de resulterande peptiderna separeras kromatografiskt, desorberas och joniseras. De resulterande föregångarjoner är m / z filtreras genom den första quadrupole (Q1) och splittrad i den andra fyrfaldiga (Q2) genom att kollidera dem med en kollision gas. De resulterande fragmentjoner är m / z-filtreras i tredje quadrupole (Q3) och kvantifieras enligt en dynod. Varje föregångare och fragmentjon par kallas en övergång, och varje övergång övervakas under en viss tidsperiod (uppehållstiden, typiskt 2-50 ms). Under LC-SRM, de qqq-MS går igenom en fördefinierad lista med övergångar (duty cycle är typiskt ≤3 sek), och ett kromatogram av varje övergång produceras. Alternativa strategtalet för protein kvantifiering använder vanligtvis immun såsom dot-blottar, Western blöts, ELISA, mikroarrayer antikropps omvänd fas protein mikroarrayer, mikroflödesimmun, digitala ELISA och mikrosfärbaserade immun 7. De bästa immun kan vara betydligt känsligare än LC-SRM, och provkapacitet av immun kan vara betydligt högre än för LC-SRM 5. Däremot kan utveckla immun vara dyrt och / eller tidskrävande, och de resulterande analyser kan vara sårbara för korsreaktivitet och / eller störningar oförenligt med cell / vävnads lys / homogenisering metoder, och / eller inte mottagliga för multiplexering 5,8. Några av dessa frågor kan lösas genom att koppla antikropps och MS-baserade tekniker. Till exempel kan målproteiner berikas med hjälp av immunoutfällning före proteolys och LC-SRM 9-12. Alternativt använder SISCAPA tekniken immunoprecipitation efter proteolys vid peptid level 13,14. Förutom immunoenrichment strategier kan immunotömning av hög förekomst proteiner användas för att öka LC-SRM känslighet genom att reducera interferens genom coeluting analyter 15,16. MS-baserade protein kvantifiering kan delas in i relativ och absolut kvantifiering, och även i etikett fri och stabil isotop märkning (t.ex. metabolisk märkning, kemisk märkning, och tung-märkta protein- och peptid interna standarder). Märkningsfria tekniker kan vara användbara för relativ protein kvantifiering, men är olämpliga för noggrann absolut kvantifiering. Som jämförelse har märkningstekniker minskat felet i samband med provberedning och MS varians, och används ofta för relativ protein kvantifiering 17. Till exempel, stabil isotop märkt proteomet (SILAP) standarder ställdes med användning av en odlad human cellinje aktiverat relativ kvantifiering av potentiella biomarkörer via LC-SRM av humant serum 18. Exakt absolut protein kvantifiering av MS kräver att renat, kvantifieras, isotopinmärkt protein- eller peptid interna standarder spetsade-i biologiska prover innan MS. Införlivandet av tunga isotopmärkta interna standarder i en LC-SRM arbetsflöde gör absolut kvantifiering som har visat sig vara mycket reproducerbar och överföras mellan laboratorier 16,19. Stabil isotopmärkta interna standarder för absolut protein kvantifiering av MS inkluderar peptid standarder ställdes med användning av fastfassyntes 20 proteiner som består av sammansatta proteas-klyvbara peptid normer 21, och fullängdsproteinstandarder 22. Målprotein kovalent modifiering och förberedelse ofullständig prov (dvs ofullständig provlysering och homogenisering, och ofullständig protein solubilisering, denaturering, alkylering, och proteolys) kan underminera exakt kvantifiering. Intern protein standarder är minst benägna att påverkas av de flesta av dessa potentiella problem, men de är oftast svårast att förbereda. Ett alternativ är att analysera varje målprotein använder flera interna peptid standarder som är utformade för att inkludera amino- och karboxiterminala infödda flankerande rester. Oavsett vilken typ av intern standard används, bör det spetsade-i biologiska prover på ett så tidigt gång under provberedning som möjligt. Dessutom bör flera provberedningstekniker (t.ex. olika denatureringsvillkor) testas. Användningen av flera ortogonala experimentella tekniker (experimentell tvär validering) är en hållbar strategi för att övervinna de potentiella kvantifiering utmanar 23-25. LC-SRM kvantifiering av proteiner är en mycket flexibel teknik som har använts i en mängd olika tillämpningar. Notably, har den använts för att studera peptid- och protein biomarkörer inomkliniska prover, såsom serum, kärn biopsier och fin nål aspirat 5. LC-SRM har också använts för att mäta stökiometrin för protein komplex 5,26, för att detektera botulinneurotoxiner 27, för att kvantifiera protein fosforyleringsställen dynamik inom signalvägar 5, och för att kvantifiera förändringar i proteinkonformation 28. Vårt laboratorium använder LC-SRM att kvantifiera de signalerande proteiner som förmedlar makrofager kemotaxi för att stödja utvecklingen av kemotaxi pathway simuleringar. Den övergripande planen för protokollet (Figur 1) börjar med ranking trevande målpeptider. Därefter råa externa peptid standarder syntetiseras och användas för att utveckla LC-SRM analyser för kvalitativa analyser av biologiska prover. Om det biologiska provet härrörande målpeptiden upptäcks, är renade tunga märkta interna peptid standarder förberedd för kvantitativ LC-SRM. Detta protokoll kan användas för att accurately kvantifiera proteiner från ett brett utbud av biologiska prover, och för att stödja undersökningar av ett stort antal olika proteinmål.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture EDTA, 500mM, pH8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 disposable counting chambers</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, LC-MS grade, ampules</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-10X1AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>0640030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M, pH 7.2</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3028-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Magic C18AQ, 5&#181;m, 200&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM5/61200/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Halo ES-C18, 2.7&#181;m, 160&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM3/93100/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC coated silica capillary, 50&#181;m id</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>200-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>500-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase, from Photinus pyralis</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9506-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>516481-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>9586-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04906837001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT023590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SPD111V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube decapper for Micronic tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1765-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

Utvecklingen av prediktiva beräkningsmodeller av signaltransduktionsvägar är en av de grundläggande målen för systembiologi 53. Tyvärr, även för signalvägar som har studerats i stor utsträckning och har en hög klinisk betydelse, är det fortfarande i allmänhet inte möjligt att kvantitativt förutsäga väg beteende som svar på störningar (t.ex., är detta sant för MAPK / ERK väg 54). Nyligen en undersökning anställd riktade proteomik, transkriptomik och datormodellering...

Watch this Scientific Journal Video about Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification at JoVE.com

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Vald Reaction Monitoring masspektrometri för Absolute protein kvantifiering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Analysera stora proteinkomplex från struktur-masspektrometri

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

T-vågen Ion Mobility-masspektrometri: Grundläggande experimentell Rutiner för Protein Komplex analys

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kvantifiering av proteiner med Peptide Immunoaffinity Anrikning kombination med masspektrometri

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Tiol Redox Proteome Användning Isotope spektrometri Taggning Mäss

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Ett protokoll för identifiering av protein-proteininteraktioner Baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk märkning, immunoutfällning, kvantitativa masspektrometri och Affinity modulering

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Kopplade Analyser för övervakning Proteinåterveckningssteg i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av extracellulära matrixproteiner från vävnader och matsmältning i peptider för masspektrometri analys

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Att kombinera kemisk Cross-linking och masspektrometri av intakt proteinkomplex att studera arkitekturen av flera subenhet Protein församlingar

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...