Name: production of nurr-1 specific polyclonal antibodies free of cross-reactivity against its close homologs, nor1 and nur77
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77 at JoVE.com

This work was supported by NIH grants (NS070577 and NS084869).

הערה: ניתן למצוא ההרכב של כל הפתרונות שהובאו להלן בטבלת חומרים / ציוד. 1. חלבון טור נוגדן טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן חלבון טור ספין וכל מאגרים הנדרשים לטמפרטורת חדר במשך 15 דקות לפני תחילת ההליך. </li><...

<ol>
	<li>Hawk, J. D., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+NR4A+transcription+factors+in+memory+formation.">The role of NR4A transcription factors in memory formation.</a> Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).</li><li>Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+new+brain-specific+transcription+factor,+NURR1.">Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1.</a> Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).</li><li>Zetterstr&#246;m, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neuron+agenesis+in+Nurr1-deficient+mice.">Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice.</a> Science. 276 (5310), 248-250 (1997).</li><li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurr1+is+required+for+maintenance+of+maturing+and+adult+midbrain+dopamine+neurons.">Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons.</a> J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).</li><li>Decressac, M., Volakakis, N., Bj&#246;rklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NURR1+in+Parkinson+disease--from+pathogenesis+to+therapeutic+potential.">NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).</li><li>Pe&#241;a de Ortiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+Expression+of+the+Orphan+Nuclear+Receptor+Gene+hzf-3/nurr1+during+Spatial+Discrimination+Learning.">Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning.</a> Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).</li><li>Vecsey, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+enhance+memory+and+synaptic+plasticity+via+CREB:CBP-dependent+transcriptional+activation.">Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation.</a> J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).</li><li>Col&#243;n-Cesario, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Nurr1+in+the+rat+hippocampus:+implications+to+spatial+discrimination+learning+and+memory.">Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory.</a> Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).</li><li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation.">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).</li><li>Hawk, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NR4A+nuclear+receptors+support+memory+enhancement+by+histone+deacetylase+inhibitors.">NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors.</a> J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).</li><li>Bridi, M. S., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NR4A+orphan+nuclear+receptors+mediate+transcription-dependent+hippocampal+synaptic+plasticity.">The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity.</a> Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).</li><li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data.">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Zetterstr&#246;m, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+the+immediate+early+transcription+factors+Nurr1+and+NGFI-B+suggests+a+gene+regulatory+role+in+several+brain+regions+including+the+nigrostriatal+dopamine+system.">Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).</li><li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+(NGFI-B)+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization.">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li></ol>

ההצלחה של פרוטוקול זה מסתמכת על הזמינות של חלבונים טהורים לאפיון הנוגדנים שהועלו נגד חבר ספציפי של משפחת החלבון של עניין. אין צורך לטהר את הנוגדנים באמצעות חלבון / G עד שברור נקבע כי יש reactivities הצולב משמעותי על ידי ELISA ומערבי סופג. כ...

גורם שעתוק Nurr1 וhomologs שלה (Nur77 וNor1) שייכים ל4A קולט הגרעיני תת משפחה (NR4A) 1. הם גם קולטנים יתום כי ligands אנדוגני אינו מזוהים עדיין. Nurr1 היה משובט ראשון בשנת 1992 ולמרות שידוע שבאו לידי ביטוי במוח 2, תפקידה החיוני לפיתוח ותחזוקה של נוירונים דופמין המוח התיכון התגלה על ידי מחקרי עכבר נוקאאוט 3. בנוסף, התפקיד החשוב שלה לצורך התחזוקה של נוירונים דופמין המוח התיכון הודגם לאחרונה על ידי מחקר בנוקאאוט מותנה 4. בשל מחקרים האלגנטיים אלה מראים התפקידים הקריטיים של Nurr1 לנוירונים דופמין המוח התיכון, מחקרים רבים שלאחר מכן התמקדו במידה רבה בנוירונים דופאמין והפרעה ניוונית של מערכת עצבים הקשורים לדופמין המוח התיכון, מחלת פרקינסון (PD) 5. יש לציין, Nurr1 מתבטא לא רק בתאי עצב דופמין המוח התיכון (מד&quot;א), אלא גם בdiאזורים במוח פסוק 2, מה שמרמז שאולי יש לו תפקידים פונקציונליים בתחומים רבים שאינו התובע, אשר נתמך במידה רבה על ידי יותר מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי Nurr1 משחק תפקידים חשובים בתפקודי מוח שונים. לדוגמאות, זה הוצג פעילויות התרמה-זיכרון שכגון למידה, או משימות היפוקמפוס תלוי אחרות לגרום לעד-רגולציה של ביטוי Nurr1 ב6,7 היפוקמפוס. בנוסף, להפיל את ביטוי Nurr1 בהיפוקמפוס היה מספיק כדי לפגוע בזיכרון לטווח ארוך ו / או פלסטיות הסינפטית 8-11, חזק המצביע על כך Nurr1 משחק תפקידים מגוונים באזורי מוח רבים. לכן, כדי להבין את ביטוי תאים מסוג ספציפי וsubcellular של Nurr1 נוסף, רצוי להשתמש נוגדני Nurr1 ספציפי, שאינו מפגינים כל תגובה צולבת לhomologs Nur77 או Nor1. מאמר זה מתאר פרוטוקול מראש ספיחה לייצר נוגדני Nurr1 ספציפי ונתונים נוספים מראים הנוכחיים הספציפי שלו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Column Storage solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AminoLink Coupling Resin and Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>44890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A spin column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330&#956;L</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-675-69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk Diluent/ Blocking Concentrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-82-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Elution Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15567-&#173;&#8208;027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;, 5, 5&#39; Tetramethylbenzydine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N H2SO4</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>H381 05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A IgG Binding Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Elution Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M Tris-&#173;&#8208;HCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column Storage solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AminoLink Coupling Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quenching buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 
			7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M NaCl, 0.05% NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes: 10 &#956;l; 20 &#956;l; 200 &#956;l; 1000 &#956;l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of nurr-1 specific polyclonal antibodies free of cross-reactivity against its close homologs, nor1 and nur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson&#8217;s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

השוואה של חלבון נוגדני Nurr1 ספציפי עמודה מטוהרת עם חלבון נוגדנים נגד Nurr1 מטוהרים ואחרי המעבר בNur77 LBD וNor1 LBD עמודות מוצגים באיור 1. כפי שניתן לראות, מטוהר נוגדן Nurr1 חלבון הציגה חזק מחייבת לNurr1 LBD. עם זאת, הוא גם הוכיח משמעותי מחייב Nur77 LBD וNor1 LBD. כאשר נוגדני Nurr1-מטוהר ח?...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77 at JoVE.com

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

ייצור של Nurr-1 Polyclonal ספציפי נוגדנים חינם של צלב-תגובתיות נגד homologs לסוגרה, Nor1 וNur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Operant Learning of Drosophila at the Torque Meter

למידה אופרנטית של תסיסנית במד מומנט

For experiments at the torque meter, flies are kept on standard fly medium at 25&deg;C and 60% humidity with a 12hr light/12hr dark regime. A standardized ...

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

הפגנה טכנית של הכלאה שלמות מערך הגנום הגנום השוואתי

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

בשנת vivo Ca 2 + - הדמיה של נוירונים גוף אינפקטד במהלך הלמידה חוש הריח של דבורת הדבש

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

זיהוי של ביטוי גנים בתאים תאיים חיים של Murine, אדם וחזירי מקור באמצעות חלקיקים שכותרתו פלואורסצנטי

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

השימוש נוגדנים Anti-פוספו-girdin להמחיש אניץ מעיים בתאי עכבר לתרשים מעי צם Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice