Name: rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior
Uploaded: 2015-09-16T14:00:00
Duration: 10 min 5 s
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MSB is supported by the Alcohol Beverage Medical Research Foundation, a Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), the National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), and startup funds provided by the Virginia Higher Education Equipment Trust Fund and the VCU School of Medicine.

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None of the authors have competing or conflicting interests.

La procédure présentée ici est un moyen efficace pour la fabrication de micro-injection canules et microinjecteurs qui aideront à élucider les substrats moléculaires de comportement motivé. Cette méthode offre plusieurs avantages. D&#39;abord, par la fabrication propres implants et microinjecteurs de un, de nouveaux paramètres expérimentaux peuvent être rapidement optimisées;-à-dire, on n&#39;a pas besoin d&#39;attendre pour les composants sur mesure pour arriver. Deuxièmement, en raison du faible diamètre de la canule, plus canules peuvent être implantés simultanément. Cela raccourcit le temps chirurgical nécessaire, ce qui peut améliorer la survie, et permet également de multiples implants par animal. Troisièmement, le logiciel utilisé pour contrôler les chambres opératoires accueille facilement les horaires de rapport progressistes depuis un ratio paradigme fixe peut être rapidement converti en un ratio paradigme progressive en appliquant simplement une liste de paramètres de transition de l&#39;événement qui contient le programme de renforcement souhaitée. Êtrelargement utile, un procédé de micro-injection a été présenté générique qui devrait être largement applicable pour la micro-injection de presque n&#39;importe quel réactif actuellement disponibles. Par conséquent, nous prévoyons que cette technique continuera d&#39;être d&#39;une grande utilité similaire à l&#39;avenir avec des modifications mineures. En changeant seulement quelques variables, cette approche peut être appliquée à un grand nombre de réactifs. Les paramètres qui le plus souvent être manipulées comprennent la longueur du micro-injecteur qui fait saillie à partir de la canule, le volume de l&#39;injection et la vitesse d&#39;injection. Par exemple, on peut vouloir l&#39;injecteur pour faire saillie plus loin de la pointe de la canule pour éviter la cicatrice gliale qui forme généralement autour des implants chroniques. En outre, on peut souhaiter pour injecter un volume plus important. Pour les micro-injections de virus du striatum, un volume de 1 ul est habituellement utilisé et ce volume est typiquement injecté sur une période de temps plus longue (souvent 7-10 min plus 3-10 min temps de diffusion supplémentaire) par rapport à l&#39;utilisation queD pour les réactifs pharmacologiques (généralement 0,3 - 0,5 pi plus de 2 - 3 min plus 1 - 3 min temps de diffusion supplémentaire). L&#39;utilisateur devrait consulter la littérature et / ou empiriquement déterminer les paramètres les mieux adaptés à leurs besoins. Peu importe, le succès de cette procédure dépend essentiellement de 4 variables: 1) la longueur de la canule, 2) la longueur de microinjecteur, 3) la qualité du modèle microinjecteur de pulvérisation, et 4) l&#39;intégrité du système avant l&#39;injection. Parce emplacement de micro-injection est fonction de la profondeur que le micro-injecteur fait saillie à partir de la canule, il est impératif que les deux canules (étape 1.2.8) et la longueur de micro-injecteur (post-flexion, l&#39;étape 2.2.1) sont à la fois connue avec précision et uniforme entre tous les sujets . Cela peut facilement être contrôlé par facilement rejeter tout mettre en œuvre ce ne est pas la longueur nécessaire à la ré-mesure finale. En outre, l&#39;emplacement d&#39;injection ne peut être prédit si elle se produit immédiatement en dessous de la canule de guidage. Ainsi, toute microinjecteur That Does pas vaporiser une longue, mince filet sur des tests (étapes 2.4.6) devraient être rejetées. Une injection de qualité est également liée à l&#39;intégrité du système avant l&#39;injection. Si après la distribution toute l&#39;eau de l&#39;injecteur (avant le remplissage avec le réactif) multiples taches sont observées sur le laboratoire-essuyer, puis une fuite doit être corrigée (Note sur l&#39;étape 2.4.8). En outre, si la bulle (étape 2.4.9) qui sépare le médicament à partir de l&#39;eau dans la tubulure PE20 est pas une, bulle unique (après remplissage de la micro-injecteur ayant réactif), puis l&#39;injecteur est partiellement obstrué. Ce sabot pourrait prévenir ou détourner l&#39;injection. Cela aussi peut être aisément remédié (Note sur l&#39;étape 2.4.8). Si l&#39;on veut micro-injection alors que l&#39;animal est dans le cadre stéréotaxique il ya trois alternatives. En premier lieu, on pourrait augmenter la longueur du col de micro-injecteur de telle sorte qu&#39;il peut être tenu fermement par le manipulateur stéréotaxique et également prolonger suffisamment loin pour permettre la connexion à un tube PE20. D&#39;autre part, sure temporellement pourrait implanter une canule et d&#39;utiliser la norme microinjecteur présenté ici. Troisièmement, on pourrait utiliser dessinée et des pipettes en verre poli. 16,17 Une limitation importante de la procédure présentée ici est qu&#39;il est mieux menée chez le rat bien gérées qui sont familiers avec la procédure. Les rats utilisés pour les données décrites dans la section des résultats nécessaires pas de procédures spéciales de manipulation parce que le même enquêteur manipulé des rats sur une base quotidienne pendant plus de 2 mois. Cela comprenait l&#39;observation quotidienne et la manipulation de l&#39;implant chirurgical pendant au moins 2 semaines. Cependant, les rats peuvent être habitués rapidement par un certain nombre de techniques qui sont utilisées pour avant l&#39;essai d&#39;inhibition de pré-impulsion, qui peut être affecté par le stress. Ces techniques d&#39;habituation spéciales ont été bien détaillé précédemment. 43 En plus de ces procédures, il est conseillé que les rats sont habitués à la procédure de microinjection où microinjecteurs raccourcis sont utilisés duanneau injections «fictives». Au cours de ces injections simulées, il est essentiel que le microinjecteur pas dépasser dans le tissu afin de limiter les dommages aux tissus. En d&#39;autres termes, le micro-injecteur ne doit pas être plié plus de 14 mm. Ainsi, l&#39;accoutumance complet requis pour la mise en oeuvre optimale de cette technique peut être considérée comme une limitation. Bien que plusieurs paradigmes comportementaux existent pour mesurer la motivation, le rapport progressif est couramment utilisé pour quantifier l&#39;effort que l&#39;objet est disposé à exercer pour obtenir un renforcement. Le ratio paradigme progressif produit une mesure connue sous le nom de point d&#39;arrêt, qui est souvent défini comme le nombre maximal de presses à levier dans le dernier rapport complété;..-À-dire, répondre maximale qui a généré un renforçateur 21 Le ratio progressive est sensible à renforçateur grandeur. Par exemple, la cocaïne supérieur (ou saccharose) doses produisent un point d&#39;arrêt supérieur et de la cocaïne inférieure (ou saccharose) doses donnent une breakp inférieureoint. 21,22 conséquent, point d&#39;arrêt est un proxy utilisé couramment pour la motivation et / ou l&#39;efficacité de renforcement. 21,23-26 Parce que l&#39;intention du point d&#39;arrêt est de déterminer quand l&#39;animal cesse de répondre, un paramètre important du rapport progressive paradigme est durée de la session. Longueurs de session finis peuvent mettre un faux plafond sur les valeurs de point d&#39;arrêt, ce qui peut être exacerbée par des pré-traitements qui diminuent anormalement le taux d&#39;auto-administration ou cette augmentation post-renforcement pause. Cette confondre peut être surmonté par un certain nombre d&#39;approches;.. Par exemple, des séances qui se terminent lorsque l&#39;animal a retenu répondre par un multiple de l&#39;intervalle moyen entre perfusion 44 Une variante plus couramment appliquée de cette approche est de mettre fin à des sessions fois répondre a été retenu par une valeur déterminée de façon empirique qui est maintenue constante dans toutes les disciplines. Nous avons fourni la méthode à appliquer cette approche à l&#39;étape 4.4.9.11.

Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions4. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry1,11,12.
While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,13 which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,14 which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles15 or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,18-20 these procedures will not be covered here.
We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. 21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,21,24 we will focus mainly on practical concerns.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cannula Tubing</td>
			<td>Amazon Supply/ Small Parts</td>
			<td>HTXX-26T-60</td>
			<td>26 gauge, Hypotube S/S 316-TW 26GA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obturator</td>
			<td>Amazon Supply/ Small Parts</td>
			<td>GWXX-0080-30-05</td>
			<td>33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector Wire</td>
			<td>MicroGroup</td>
			<td>33RW 304</td>
			<td>33 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>3924AC</td>
			<td>Liquid, Non-gel, can be autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector Plastic Tubing</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>427406</td>
			<td>PE20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Weight Hemostats</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501241-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-016</td>
			<td>150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#7 Forceps</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52100-77</td>
			<td>Dumont, Dumostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Tool</td>
			<td>Dremmel</td>
			<td>285</td>
			<td>Two-speeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut-off Disc</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3602</td>
			<td>15/16&#34; x 0.025&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PhD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ul Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7001KH</td>
			<td>Needle Style: 25s/2.75&#34;/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Wipes</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operant Software</td>
			<td>Coulbourn</td>
			<td>Graphic State</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operant Chambers</td>
			<td>Coulborun</td>
			<td>Habitest</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Ici, nous montrons des exemples de résultats qui peuvent être obtenus avec le procédé ci-dessus. Montré premier est un quartier typique qui est transfectées par des vecteurs viraux (Figure 3). En général, un volume de ~ 1 transfectées 3 mm est obtenue dans un tissu striatal. Le volume de la région transfectée peut être quantifiée à travers des sections en série à l&#39;aide de la méthode de Cavalieri 32 Fait important, le volume transfectées dépend de nombreux facteurs tels que le type de tissu étant transfectée. sérotype viral; promoteur; débit et le volume injecté; nombre de particules injectées; injecter pH; et si réactifs hyperosmolaires, tels que le mannitol, ont été utilisés. 33,34 Typiquement, nous micro-injection 10 12 particules / ml, 1 pl / latéraux plus de 10 min, et laissez 7 min supplémentaires avant de remplacer obturateurs. En outre, le produit à injecter est généralement autour de pH 8. Ensuite, nous montrons que la motivation peut être manipulé par soit l&#39;expression du transgène (figure 4)ou une micro-injection de réactif pharmacologique (figure 5). Dans la figure 4, nous avons exprimé un récepteur Designer Exclusivement Activé par Designer Drugs (de DREADDs). La région codante du récepteur a été suivie par DREADD un site d&#39;entrée de ribosome interne et une cassette mCitrine. Le mCitrine permet la visualisation commode de cellules transfectées. Le DREADD a été couplé à la protéine G hétérotrimérique-Gaq. Activation du couplage DREADD Gaq peut stimuler les astrocytes, 28,35 et la DREADD lui-même peut être activé par l&#39;administration systémique de la clozapine N-oxyde (CNO, 3 mg / kg, ip). Les rats ont été formés 14,22,36 à levier répondre pour le renforcement de l&#39;éthanol, où 3 presses à levier ont donné une chance de boire pendant les jours 1 h séances de plus de 60 jours consécutifs. Ensuite, les rats ont été contraints à l&#39;abstinence, et DREADDs Gaq couplés ont été exprimés dans le noyau accumbens astrocytes de base. Après trois semaines d&#39;abstinence, la motivation à l&#39;auto-ADMI<html> nistre de l&#39;éthanol a été mesurée par point d&#39;arrêt. 21,27-30 activation du noyau accumbens astrocytes de base, par l&#39;intermédiaire de l&#39;administration systémique CNO, a diminué la motivation des rats pour reprendre l&#39;éthanol auto-administration après l&#39;abstinence par rapport à un véhicule. Surtout, le CNO n&#39;a eu aucun effet dans une cohorte aussi formé qui exprimait la protéine fluorescente verte au lieu de la DREADD. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig3.jpg" /> Figure 3. striatum ventral région Représentant transfectées par le virus microinjecté. Cette image illustre la région du noyau accumbens astrocytes qui ont été transfectées en suivant la méthode ci-dessus. Les données sont reproduites à partir de Bull et al. 13 avec la permission du titulaire du droit d&#39;auteur. Les détails peuvent être trouvés dans cette publication et le matériel complémentaire d&#39;accompagnement.blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig4.jpg" /> Figure 4. Motivation des rats à auto-administrer de l&#39;éthanol a été réduite par l&#39;activation d&#39;un transgène qui a été sur-exprimé dans le noyau accumbens astrocytes de base. Le virus a été microinjecté et la motivation mesurée par point d&#39;arrêt après avoir laissé une semaine pour le virus d&#39;exprimer. Le transgène exprimé était un créateur Receptor Exclusivement Activé par Designer Drugs (de DREADDs). Une ANOVA à sens unique (F (2,30) = 3,29, p = 0,04), suivie par un post-hoc Scheffé révélé que l&#39;activation de la DREADD par l&#39;administration systémique de la clozapine N-oxyde (CNO, 3 mg / kg, ip ) réduit de façon significative la motivation des rats à auto-administrer de l&#39;éthanol après l&#39;abstinence par rapport à un véhicule CNO n&#39;a eu aucun effet dans une cohorte aussi formé qui exprimait la protéine fluorescente verte (GFP) au lieu de la DREADD. Les données sont reproduites à partir de Bull et al. 13 avec la permission du titulaire du droit d&#39;auteur. Les détails peuvent être trouvés dans cette publication et le matériel complémentaire d&#39;accompagnement. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig5.jpg" /> Figure 5. microinjection de Gap bloqueurs de jonction a augmenté la motivation des rats à l&#39;auto-administrer éthanol après l&#39;abstinence Deux bloquants des jonctions lacunaires ont été évalués pour leur effet sur ​​la motivation (mesurée par l&#39;intermédiaire de points d&#39;arrêt) de rats à l&#39;auto-administrer de l&#39;éthanol:. Méfloquine et 18- a-acide glycyrrhétinique (18-α). Une ANOVA à deux voies a révélé que la micro-injection de bloqueurs écart-jonction dans le noyau accumbens base a augmenté la motivation des rats à l&#39;auto-administrer éthanol après l&#39;abstinence (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). Les données sont reproduites à partir de Bull et al. 13 avec la permission du titulaire du droit d&#39;auteur. Les détails peuvent être trouvés dans cette publication etle matériel complémentaire d&#39;accompagnement.

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Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Le cerveau de rongeurs microinjection pour l&#39;étude de substrats moléculaires de Motivé Comportement

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