Name: double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue at JoVE.com

Författarna vill tacka C. Roderigo för teknisk experthjälp. Vi tackar S. Köhler (Center of Advanced Imaging, Heinrich Heine-universitetet Düsseldorf) för att få hjälp i videoproduktion. Forskning i författarens laboratorium har finansierats av det tyska Research Association (DFG: Ro 2327 / 8-1 till CRR), Heinrich Heine-universitetet Düsseldorf (NH) och National Institutes of Health bevilja R01NS032123 (till MC).

<ol>
	<li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+the+brain:+implications+for+pathophysiology.">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li><li>Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+changes+in+extracellular+Na++and+Cl-+concentration+in+relation+to+changes+in+the+size+of+the+extracellular+space.">Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space.</a> Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).</li><li>Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+potassium+changes+in+extracellular+microenvironment+of+cat+cerebellar+cortex.">Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex.</a> J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).</li><li>Rice, M. E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-+and+aspartate-induced+extracellular+potassium+and+calcium+shifts+and+their+relation+to+those+of+kainate,+quisqualate+and+N-methyl-D-aspartate+in+the+isolated+turtle+cerebellum.">Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 38, 295-310 (1990).</li><li>Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+extracellular+potassium+activity+in+cat+cortex.">Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex.</a> Brain Res. 50, 489-495 (1973).</li><li>Deitmer, J. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+regulation+and+proton+signalling+by+glial+cells.">pH regulation and proton signalling by glial cells.</a> Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).</li><li>Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+modulation+of+pH+in+the+brain.">Regulation and modulation of pH in the brain.</a> Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).</li><li>Kofuji, P., Newman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system. , (2009).</li><li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment.">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).</li><li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+use+of+high-speed,+concentric+h+-+and+Ca2+-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording.">Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).</li><li>Stephan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kir4.1+channels+mediate+a+depolarization+of+hippocampal+astrocytes+under+hyperammonemic+conditions+in+situ.">Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ.</a> Glia. 60, 965-978 (2012).</li><li>Haack, N., Rose, C. R., Lei, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+Calibration+and+Application+of+Potassium-Selective+Microelectrodes.">Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes.</a> Microelectrodes. , 87-105 (2014).</li><li>Roos, A., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH.">Intracellular pH.</a> Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).</li><li>Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+Intracellular+Sodium+Imaging+Combined+with+UV-mediated+Focal+Uncaging+of+Glutamate+in+CA1+Pyramidal+Neurons.">Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Hertz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+astrocytic+Na+,K+-ATPase+and+glycogenolysis+for+K+homeostasis+in+mammalian+brain.">Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain.</a> J Neurosci Res. , (2014).</li><li>Pumain, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-+and+amino+acid-induced+calcium+and+potassium+changes+in+rat+neocortex.">Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex.</a> J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).</li><li>Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+AMPA,+NMDA+Induced+Changes+in+Extracellular+Space+Volume+and+Tortuosity+in+the+Rat+Spinal+Cord.">Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).</li><li>Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+glutamate+is+not+necessary+for+the+generation+of+epileptiform+neuronal+activity+in+hippocampal+slices.">Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices.</a> J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).</li><li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission.">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322, 1551-1555 (2008).</li><li>Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+changes+and+alterations+in+the+size+of+the+extracellular+space+during+epileptic+activity.">Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity.</a> Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).</li><li>Zanotto, L., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate+and+glutamate+induced+reductions+in+extracellular+free+calcium+and+sodium+concentration+in+area+CA1+of+'in+vitro'+hippocampal+slices+of+rats.">Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats.</a> Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).</li><li>Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+making+ion-selective+microelectrodes+suitable+for+intracellular+recording+in+vertebrate+cells.">A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells.</a> J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).</li><li>Ammann, D., Anker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutral+carrier+sodium+ion-selective+microelectrode+for+extracellular+studies.">Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies.</a> Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).</li><li>Deitmer, J. W., Schlue, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Na++and+Ca2++in+leech+Retzius+neurones+during+inhibition+of+the+Na+-K++pump.">Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump.</a> Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).</li><li>Schwiening, C. J., Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+intracellular+calcium+and+its+muffling+measured+by+calcium+iontophoresis+in+snail+neurones.">Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones.</a> J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).</li><li>Chesler, M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+of+astrocytes+increases+rapidly+with+cortical+stimulation.">Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation.</a> Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).</li><li>Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valinomycin-based+K++selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance.">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).</li><li>Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate-dependent+changes+of+intracellular+sodium+and+pH+in+identified+leech+glial+cells.">Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells.</a> Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).</li><li>Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+recording+ion+specific+microelectrodes:+their+use+in+pharmacological+studies+in+the+CNS.">Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS.</a> Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).</li><li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum.">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li><li>Chesler, M., Chan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+extracellular+pH+transients+in+the+in+vitro+turtle+cerebellum.">Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 27, 941-948 (1988).</li><li>Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+sodium+activity+and+the+sodium+pump+in+snail+neurones.">Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones.</a> J Physiol. 220, 55-71 (1972).</li></ol>

The authors declare no competing interests.

Vätske carrier-baserade, jonselektiva elektroder har framgångsrikt använts i årtionden och för många joner, mycket specifika sensorer finns 22-26. Vid användning i det extracellulära utrymmet (ECS) av ryggradsdjur hjärnan preparat, måste man ha i åtanke är dock att detta är en ganska invasiv teknik: medan bredden på ECS är endast cirka 20-50 nm, diameter jonselektiva microelectrodes är cirka 1 pm (dubbelpipiga elektroder) eller större (koncentriska elektroder). Spetsarna på jonselektiva mikroelektroder kommer således inte bara skada vävnaden under impalement av vävnaden, men också förstora ECS, som främjar en underskattning av jon transienter. Trots dessa fallgropar, extracellulära jon transienter som svar på nervaktivitet är anmärkningsvärt konsekvent mellan olika laboratorier 7,8, styrker tillförlitligheten av denna metod. Prestandan och lämplighet jonselektiva elektroderär beroende av deras känslighet och selektivitet, som definieras av sensor cocktail (&quot;vätskemembran jonofor&quot;) som används. Sensor drinkar innehåller en speciell bärarmolekyl, t.ex. valinomycin för K + -selektiv mikroelektroder som uppvisar en hög selektivitet för kalium 27. Trots detta kan korsreaktivitet med andra joner förekommer och måste testas. Valinomycin uppvisar en signifikant korsreaktivitet för ammonium, som måste beaktas vid tolkning av resultaten (t.ex. 11,12). Vidare eftersom spänningen-svaret hos jonoforer följer en Nernstian beteende (jfr ekvation 1), signal-till-brusförhållande och tröskeldetektering beror på koncentrationen av jonen, som skall mätas. Således, medan små [K +] o transienter framkalla stora spänningsändringar mot låga baslinjen [K +] o, liten [Na +] o transienter är mycket svårare att upptäcka mot high baslinjen [Na +] o (se Figur 5 och 6). Utförandet av jonselektiva elektroder bestäms också av tidsupplösning, som till stor del styrs av den elektriska tidskonstant. Den senare bestäms huvudsakligen av den axiella resistansen hos sensorn, och av den fördelade kapacitansen längs längden av pipetten, mellan sina interna lösningar och det yttre fluidumet. I den dubbelpipiga konfiguration, är resistansen hög, på grund av den lång kolonn av återfyllt jonsensor. För ett givet isolerande dielektrikum (i detta fall borsilikatglas), är kapacitansen styrs av den dielektriska tjocklek. I dubbelpipiga elektroder, uppgår den dielektriska bredd till glasväggen av pipetten. Som glaset tunnar nära spetsen, faller den dielektriska bredd, och kapacitansen ökar. Dessa faktorer samverkar för att producera elektroder med svarstider som sträcker sig från flera hundra millisekunder till flerasekunder, eftersom dessa faktorer är varierande. En stor fördel med den koncentriska utformning är att såväl den axiella motståndet och kapacitansen till badet är kraftigt minskat. De koncentriska pipett shuntar de flesta av resistansen av den återfyllda jonbytare, vilket innebär att endast en kvarleva i de sista få mikrometer före spetsen. Dessutom är fyll lösning inom den koncentriska pipetten fysiskt distanserade från badet, åtskilda av tjockleken av två glasväggar, vilket kraftigt minskar kapacitansen. Som framgått tidigare 10, är den kombinerade effekten av minskad resistans och kapacitans en förbättring av tidsupplösning av två storleksordningar. I fallet med koncentriska Ca2 + och pH-mikroelektroder, 90% svarstider var så låg som 10 till 20 ms 10. En besläktad fördel med den koncentriska utformningen är den lägre brusnivå (se Figur 8). På grund av den kraftigt minskad motståndskraft, spänningstransienter från någon Ambient buller minimeras. Dessutom är återhämtning från sådana transienter snabb, på grund av den snabba tidskonstanten. Sådana artefakter är därför liten och snabb och har en mindre störande effekt på fysiologiska inspelningar (se Figur 8). Det finns också nackdelar med den koncentriska teknik. För det första är deras montering mer komplex och tidskrävande. En andra nackdel är behovet att placera en separat referensmikroelektrod med sin spets, vilket innebär användning av antingen ett separat mikromanipulator eller en specialiserad dubbel manipulator. Slutligen kan dubbelpipiga microelectrodes utökas till en trippel pipa design, möjliggör detektion av två olika jonslag samtidigt 28, vilket inte är möjligt för koncentriska elektroder. Vanligaste fallgropar Ineffektiv silanisering. Det viktigaste steget, och främsta hindret i tillverkning av alla vätske-senseller baserade jonselektiva mikro är silaniseringen förfarandet. När elektroderna inte svarar på förändringar i specifik jonkoncentration, eller svara med en sub-Nernstian respons (dvs väl mindre än 58 mV per tiofaldig skillnad koncentration), är dålig effekt av silanisering typiskt orsaken. I vår erfarenhet, kan detta inträffa om luftfuktigheten är för hög eller för låg, typiskt förhållanden på höjden av sommaren, eller vintern, respektive. Om det är möjligt att utöva en viss kontroll över rumsfuktighet, kan dessa problem övervinnas. Elektrod resistansen är för hög. Vid behov kan resistansen hos jonkänsliga fat minskas genom fasning. För detta ändamål utsätter dess spets till en stark stråle av ett slipmedel suspenderat i vatten i ett par sekunder. Detta kommer att orsaka dess översta spets för att bryta och sänka motståndet till det önskade värdet. Saltbryggor. Saltbroar mellan jon och referens fat leder till dåligt eller ingen-svarande elektroderna och kan därmed också kraftigt förvirra sina resultat i kalibreringen. Som nämnts ovan (se punkt 1.6.), Är detta främst en fråga när dubbelpipiga theta glas väljs, men är en sällsynt företeelse när du använder offset, vridna fat teknik som beskrivs här. Med enkel tillverkning i åtanke, kan ofta användas den ursprungliga dubbelpipiga utformning av Lux 29 lönsamt. Denna metod använder pre-fyllning av jon och referens fat med saltlösningar, en snabb exponering för en silanlösning genom sin sug och utvisning från spetsen, följt av inkorporering av jonbytare, även via spetsen (se 30,31) . Dessa elektroder kan tillverkas på ungefär 10 minuter, men deras spetsstorlek är typiskt 4 um eller mer och de är mer benägna att misslyckas under ett experiment. I motsats till metoder som silaniseringen innebär exponering för silanånga och värmeIng kan producera elektroder med mindre tips som varar dagar och ibland veckor. Sammantaget finns det flera protokoll och metoder om hur du förbereder jonselektiva microelectrodes. Här har vi beskrivit två huvudsakliga förfaranden för tillverkning av tvinnade dubbelpipiga samt koncentriska mikroelektroder som fungerar bra och tillförlitligt i våra laboratorier, med en total framgång på nära 100%. Viktigare, kommer dessa tekniker kunna överlåtas till mätning av andra joner arter, däribland pH eller kalcium, och kommer också att kunna tillämpas på andra beredningar än i hjärnan, inklusive vätskefyllda hålrum eller vätskor i allmänhet. Sist men inte minst, jonselektiva microelectrodes tillåter bestämning av jonkoncentrationer inuti celler. På grund av deras relativt stora spetsstorlek (~ 1 pm), detta kommer dock att vara möjligt endast i celler med en stor cellkroppen, t.ex. sådana som finns i ryggradslösa preparat 28,32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1. 
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10. 
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Abrasive&#160;&#160;</td>
			<td>MicroPolish&#160;</td>
			<td>Buehler GmbH</td>
			<td>Dissolved in A.dest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>1405059</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC 150 F-15&#160;</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the sensor of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC100-F-15</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the reference of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-200TF-15&#160;</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-120TF-10</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>1322A</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrometer amplifier with headstage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Rin = 10T&#937; and Ibias=50fA-1pA (commercially available&#160; alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Commercially available from e.g.&#160; Warner Instruments,USA;&#160; Scientifica, UK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furnace</td>
			<td></td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Must stay constant at 200&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard sticky wax / dental wax&#160;</td>
			<td>Deiberit 502&#160;</td>
			<td>Siladent Dr. Boehme &#38; Schoeps GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Must stay constant at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrodes holder made of plexiglas</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Double-barreled: o.d.&#160; capillaries 1.5 mm, concentric: o.d.&#160; capillaries 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td></td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>MD4R</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>M205C</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Plan 0.8xLWD</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Sutter Instruments&#160;</td>
			<td>Sensor of concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>Picospritzter Type II</td>
			<td>General Valve TM Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel dovetail stage</td>
			<td>DT 25/M</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component glue</td>
			<td>&#160;Araldite</td>
			<td>Huntsman advanced materials GmbH</td>
			<td>One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silverwire</td>
			<td>99.9%&#160;</td>
			<td>Wieland Edelmetalle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer / Vibratome</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>AxoScope 8.1&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical puller&#160;</td>
			<td>Type PE-2</td>
			<td>Narishige Scientific Instruments</td>
			<td>With a revolvable chuck for&#160; double-barreled microelectrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x/y translational stage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Compound</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1(S),9(R)-(&#8722;)-Bicuculline methiodide</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>14343</td>
			<td>Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td>Activates NMDA and non-NMDA and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),&#160; mGluRs and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ionophore I - cocktail B</td>
			<td>Fluka&#160;</td>
			<td>60403</td>
			<td>Based on valinomycin; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II - cocktail A</td>
			<td>Fluka&#160;&#160;</td>
			<td>71178</td>
			<td>Based on ETH 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultra pure</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W3500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

<html> För övervakning [K +] o och förändringar av detta som svar på excitatoriska aktiviteten, en dubbelpipig kaliumselektiva mikroelektrod insattes i stratum radiatum av CA1-området. Några minuter efter impalement, den jonselektiva fat av elektroden nått en stabil baslinje (Figur 7A), vilket motsvarar ett [K +] o av ca 2,8 mM, ett värde som ligger nära den [K +] i ACSF används ( 2,5 mM). Bad applicering av 0,5 mM glutamat för 10 sek inducerade en reversibel ökning av [K +] o med ca 4 mM, följt av en undersväng under baslinjen som uppgår till ~ 0,7 mM (figur 7A). Sänkning av glutamatkoncentrationen till 0,4, 0,3 och 0,2 mM orsakade en motsvarande minskning i amplitud både övergående ökning och undersväng i [K +] o (Figur 7A). oad / 53058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; Figur 7. Extracellulära kalium transienter som svar på excitatoriska aktivitet. (A) [K +] o transienter, bestående av en ökning följt av en undersväng under baslinjen, framkallad av bad tillämpning av olika koncentrationer av glutamat i 10 sekunder som anges. (B) Inverkan av en perfusion med glutamatreceptorblockerare (CNQX, 100 iM, APV, 100 M) och tetrodotoxin (TTX, 0,5 M) på [K +] o transienter induceras genom bad tillämpning av 0,5 mM glutamat under 10 sekunder. (C) Spontan [K +] o transienter i närvaro av 0mg 2+ / BIC. Experiment som visas i AC utfördes med användning av dubbelpipiga elektroder. För illustrationssyfte, var spår jämnas med en Sawitzky-Golay filter (bredd 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">Vänligen cl</a>ick här för att se en större version av denna siffra. Tidigare experiment har visat att sådana glutamat-inducerad [K +] o signaler inte påtagligt förändras under applicering av TTX, och är därmed i stort sett oberoende av öppnandet av spänningskänsliga natriumkanaler och neuronal aktionspotential generation 15,16. Att studera mekanismerna bakom de observerade [K +] o förändringar som svar på glutamat, tillämpade vi glutamatreceptorblockerare, nämligen CNQX (100 iM, blockerare av AMPA-receptorer) och APV (100 iM, blockerare av NMDA-receptorer) i närvaro av TTX (0,5 M). Vid bad perfusion med dessa blockerare, glutamatinducerad [K +] o förändringar var praktiskt taget avskaffats, bekräftar deras beroende av öppnandet av jonotropa glutamatreceptorkanaler såsom rapporterats tidigare (t.ex. 17, Figur 7B). För att ytterligare visa tHan relevans glutamaterga excitation för generering av extracellulärt [K +] signaler, var skivor perfusion med nominellt Mg 2+ -fri saltlösning innehållande 10 iM bicucullin metiodid (0mg 2+ / BIC). Detta lindrar spänningsberoende Mg 2+ -block av NMDA-receptorer och dämpar inhibition genom att blockera GABA A-receptorer, vilket spontan återkommande epileptiform aktivitet i nätverket (t.ex. 18,19). Som väntat 20, spontan, återkommande [K +] o transienter, som uppgår till ca 1,5 mM detekterades i 0mg 2+ / BIC saltlösning (Figur 7C). Mellan dessa svar, mindre [K +] o transienter med en genomsnittlig amplitud av omkring 0,2 mM inträffade (figur 7C). I en andra uppsättning experiment använde vi [Na +] -känsliga microelectrodes att bestämma [Na +] o förändringar framkallade genom tillämpning avglutamat agonister. Här har vi också jämfört svarsegenskaperna hos dubbelpipiga och koncentriska mikroelektroder som använder två olika applikations paradigm. [Na ^] -känsliga mikroelektroder placerades in i stratum radiatum på ett djup av ca 50 ^ M. Efter en stabil baslinje uppnåddes, var glutamatagonist-L-aspartat tillämpas per bad perfusion (10 mM, 120 sekund, bad perfusion vid 2,5 ml / min). Såsom observerats tidigare 21, tillämpning av aspartat orsakade en långsam minskning av [Na +] o med ca 15 mM, som varade ca 5 minuter och sedan började återhämta sig tillbaka till baslinjen (Figur 8A). Noterbart medan toppamplituder och kinetik för [Na +] o signaler bestäms av båda elektroderna var nästan identiska under dessa förhållanden, koncentriska elektroder uppvisade en mer stabil baslinje och en lägre ljudnivå (figur 8A). För att testa r<html> esponse egenskaperna hos de olika elektroderna under ett snabbare applikation paradigm vi tryckapplicerade glutamat genom en fin glaspipett placerad i stratum radiatum på ett avstånd av 20 till 40 | im från spetsen av den jonselektiva mikroelektrod. Som väntat 21, tillämpning av glutamat (10 mM) under 200 ms förorsakade en minskning av [Na ^] o (figur 8B). De toppamplituder i nätverket [Na +] o minskning var i samma intervall för båda typerna av elektroder (dubbelpipiga: 4,5-13,5 mM, n = 14; koncentriska: 2,0-19,1 mM, n = 15). Men i motsats till de resultat som erhölls med långsam bad perfusion (se ovan), inte bara signal-till-brus-förhållande, men också tidsförloppet av [Na ^] O-signaler som detekteras av de två typerna av elektroder skilde sig signifikant. Den genomsnittliga tiden till topp var 3,5 sekunder för dubbelpipiga och endast 1,3 sekunder för de koncentriska mikroelektroder. ve_content &quot;&gt; Därför visar dessa resultat och bekräfta snabbare svars kinetik koncentriska kontra dubbelpipiga Na + -selektiv microelectrodes, (se Figur 6C och 8B), som noterades även för Ca2 + och pH-selektiva motsvarigheter 10 . Till skillnad från den tidigare studien, där korta skurar synaptiska stimulering utfördes för att framkalla snabb synaptically-inducerade ion transienter, det var bara en tendens, men ingen signifikant skillnad i medel toppamplituder mellan koncentriska och dubbelpipiga elektroder med vår ansökan paradigm. Detta berodde förmodligen på det faktum att avståndet för ansökan pipetten från spetsen av den jonselektiva mikroelektrod varieras med en faktor av två (20-40 | im), och följaktligen, att den maximala glutamatkoncentrationen vid målregionen var inte densamma i olika experiment, hindrar alla befintliga skillnaden i toppamplituder. (A) Top spår: Förändring i voltaGE av referens fat (V ref) av en dubbelpipig elektrod (svart streckad kurva) och en koncentrisk elektrod (grå spår) som svar på förändringar i badet Na * koncentration ([Na *] b) såsom anges. Notera att spänningssvaren från båda elektroderna är praktiskt taget identiska. Bottom spår: Förändringar i spänning för Na * -potential (V Na *) av en dubbelpipig elektrod (svart spår) och en koncentrisk elektrod (grå spår) som svar på förändringar i [Na *] f. (B) Halv logaritmiska tomter i nätverket [Na +] b kontra V Na + båda elektroderna. Linjära tomter av uppgifterna visar en lutning på ca 48 mV för båda elektroderna. (C) Svar för V Na * av en dubbelpipig (svart spår) och en koncentrisk elektrod (grå spår) till en snabb förändring av [Na ^] b från 152 mM till 70 mM. Notera att reaktionstiden för den koncentriska elektroden är signifikant FASTer. För illustrationssyfte, var spår jämnas med en Sawitzky-Golay filter (bredd 20). <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> Bild 8: Extracellulära natrium transienter som upptäckts av dubbelpipiga och koncentriska elektroder. (A) Övergående förändringar av Vref och [Na +] o inducerad av bad perfusion med 10 mM aspartat för 120 sek såsom indikeras av stapeln. De övre spåren visar en inspelning utförs med en dubbelpipig elektrod, var de lägre spår som spelats in med en koncentrisk elektrod. (B) Övergående förändringar i V ref och [Na +] o inducerade av lokalt tryck applikation med 10 mM glutamat under 0,2 sekunder som indikeras av pilen. De övre spåren visar en inspelning utförs med en dubbelpipig elektrod, var de lägre spår som spelats in med en koncentrisk elektrod.Prickade röda linjerna representerar linjära passar under perioden mellan början av signalen till sitt maximum. Notera att reaktionstiden för den koncentriska elektroden är betydligt snabbare under detta förhållande. För illustrationssyfte, var spår jämnas med en Sawitzky-Golay filter (bredd 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue at JoVE.com

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Dubbelpipiga och Concentric Mikroelektroder för mätning av extracellulärt Ion Signaler i hjärnvävnad

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Beredning av Mouse hjärnvävnad för Immunoelectron mikroskopi

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Fokuserad jonstråle Fräsning och Svepelektronmikroskopi av hjärnvävnad

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Konstruktion och montering av en Motoriserad Ultralätt Microdrive för kronisk neurala inspelningar i små djur

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Att göra och testning med kalium Ion selektiv mikroelektroder i vävnad skivor av vuxna hjärnan

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissektion av lokala Ca2 + signaler i odlade celler av membran-riktade Ca2 + indikatorer

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Högupplöst 3D-avbildning av rabies virus infektion i Lösningsmedelsrensade hjärnvävnad

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Märkning och avbildning av amyloida plack i hjärnvävnad med hjälp av naturliga polyfenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Horisontella Hippocampal skivor av mushjärnan

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

En hydrofobisk vävnadsrensningsmetod för råtta hjärnvävnad

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

En plattbaserad analys för mätning av endogen monoaminfrisättning i akuta hjärnskivor

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...