Name: generation and quantitative analysis of pulsed low frequency ultrasound to determine the sonic sensitivity of untreated and treated neoplastic cells
Uploaded: 2015-07-22T15:00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells at JoVE.c

The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.

1.クリーニングセルソニシステム<ol><li>ホーンとコンバータクロロホルムを使用し、綿の綿棒労働組合の間を清掃してください。さらに、金属の削りくず、さび、または酸化の蓄積を除去するために、ホーンとコンバータのスレッドに軽油や鉱物油を適用します。 </li><li>油でスレッドを拭いた後、組合から石油やその他の汚染物質を除去するためにクロロホルムを使用します。 </li></ol> 2.セルソニファイアーを再組み立てし、システムを設定します<ol><li>コンバータにホーンを取り付けます。システムを適切にトルクに、カップ（ 図2A）の底部からホーンを引いて、カップアセンブリから組み立てコンバータとホーンを取り外します。変換器（ 図2B）の上部近くに三つの小さな穴の内側にスロットレンチを置きます。そして、ホーン（ 図2B）のスロット部分に½インチのカラスの足を取り付けたトルクレンチを置きます。秒で締めtandard時計方向トルク計は、製造業者16が推奨するトルク、54.23 N。M（ 図2C）を読み込むまで。締めコンバータを取り付け、カップに戻すホーン、および直立位置にあるリングスタンドにホーンとコンバーターを搭載。実験的なパルス投与のためのシステムを設定する前に、電源へのコンバータを取り付けます。 </li><li>パルスはパルス間1秒で超音波処理の1秒を使用して投与するためのシステムを設定します。異なる投与モデルは、他の実験条件のために使用することができます。このような水の量とホーン直径などの多くの変数が、潜在的にこの投薬の変更を必要とするであろう。上記の細胞試料の種類、量、および濃度を用いて、経験的データおよび観察は、この投与計画の処方につながっています。 </li><li>所望の振幅にシステムを調整します。このプロトコルでは、sonosensitの効果をレンダリングすることになる完全な細胞破壊を防止するために、33％および50％の振幅を使用しゲージすることが困難または不可能izers。 注：この研究では振幅が比較されます。 </li></ol> 3.システムの強度や機能を評価します<ol><li>サンプルの超音波処理のレベルは1.5センチ、でキャビテーションメーターを保持します。システムが期待される強度で実行されていることを評価するために測定値を注意してください。現在のシステムと水のレベルを使用して、33％の振幅および50％の振幅のために115〜125 W / cm 2の 100〜110 W / cm 2の間で期待しています。直接W / cm 2の中にキャビテーションエネルギーを表すメータ表示からキャビテーションメーターの測定値を注意してください。水の表面でこれらの測定値を取り、泡がメートルのプローブの面に存在しないことを確認します。 注：これらの手順は、ホーン上記アクセス用のキャップなしで行われることに留意することが重要です。彼らはすべての超音波処理後に繰り返す必要はありません。むしろ、彼らは、洗浄再組み立て、システムを設定した後に実行する必要があります。 </LI&gt; <li>完全にハイドロフォンセンサーを浸漬するために、水12.5ミリリットルを含有するサンプルバイアルにハイドロホンを配置します。リングスタンドを使用して、ハイドロフォンを一時停止します。 </li><li>波形特性を評価するために、オシロスコープの入力にハイドロフォンを接続します。異常な波が、メーカーの仕様からシステムの周波数を変更することができるように、明確な正弦波のためのオシロスコープを調べます。キャビテーションメーターとオシロスコープの両方が周波数の読みを与えるが、唯一のオシロスコープは、障害が発生したシステムまたは不適切なアセンブリを示している異常な波が表示されます。 </li></ol>細胞および培地の4準備<ol><li> 240ミリリットルイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、50mlのウシ胎児血清を使用してメディアを準備します。温度の急激な上昇は、血清安定性の妥協につながることができますように、湯浴中でウシ胎児血清を解凍しないでください。 240μlのゲンタマイシンを50mg / mlおよび5ミリリットルのペニシリンは、コンバイン/標準的な培養フラスコに100Xをストレプトマイシン、培地に加えます。 4℃でメディアを保管してください。 </li><li>シードU937細胞において約4×10培地を用いて調製した25cm 2のフラスコ中で4細胞/ ml。 TC20セルカウンターとマイクロ遠心チューブに細胞を15〜20μlのトリパンブルーの15〜20μLを入れ、内容物を混合することにより、トリパンブルー排除を用いて濃縮し、生存のために細胞を評価します。 Pipette15-20 TC20サンプリングスライドに、この混合物のμL、およびTC20セルカウンターにスライドを配置することによってカウントを開始します。 </li><li> 37℃で細胞をインキュベートし、5％CO 2、およびトリパンブルー排除およびTC20セルカウンターを用いて細胞生存率を確認してください。細胞を、適切な濃度であり、および/または適切な時間枠のためsonosensitizers、転送20mlガラスシンチレーションバイアルに培養フラスコから細胞を3mlで処理されたとき。このプロトコルでは、48時間、U937細胞を成長し、その後0.5、1で処理または30分間、5 mMのMeβCDは十分に超音波処理の前に、細胞のコレステロールを枯渇させます。 </li></ol> 5.細胞超音波処理<ol><li>ドガは、脱イオン真空およびブフナーフラスコを用いて水を蒸留しました。カップホーンに水を移し、ホーンの最上部より上15mmのレベルに記入してください。超音波処理プロセスは数分の間、さらに水を脱ガスが発生し、システムは、超音波処理をサンプリングする前に実行されていない場合は、実験の過程で不整合が生じることができます。そのため、超音波処理をサンプリングする前に〜7分間システムを実行します。 </li><li>保持装置に細胞を含むシンチレーションバイアルを取り付けます。そして、カップホーンの上部に保持装置を接続して（スライド機構を用いて水の表面での）ホーンの上部から15mmの高さに設定します。 </li><li>細胞は、典型的には、1秒は、これらのパルスの各々の間に間隔をあけて、超音波の3 1秒のパルスを用いて超音波処理します。このためプロトコル、上記パルス投与を使用して33％と50％の振幅で超音波処理細胞。 </li></ol> 6.損傷後の超音波処理のための細胞を評価します<ol><li>トリパンブルーとTC20セルカウンターを用いて損傷し、生存のために懸濁した細胞を評価します。また、Z2カウンタを使用してサンプルを分析します。 Z2計数分析のために、ピペット20ミリリットルに100μlの細胞懸濁液、等張生理食塩水（200：1の比）。分析の前に、等張生理食塩水を用いて少なくとも2倍Z2粒子分析器の開口部を洗い流します。カウンターホルダーにZ2のサンプルを配置し、カウントを開始する前に、開口部のプラットフォームを上げます。 </li><li>製造業者によって提供されるソフトウェアを使用して、TC20及びZ2カウンターからデータを取得します。細胞の損傷、生存能力、および超音波処理から細胞破片を作成するためのこれらのデータを分析します。 </li></ol> 7. XTTアッセイは、細胞生存率を決定し、処理されたU937及びTHP1細胞のミトコンドリア活性に<ol><li>プリオXTTアッセイを、R、同じ条件下でU937及びTHP1細胞を成長させます。超音波処理の前に30分間MeβCDの同じ濃度範囲で細胞を前処理します。細胞は今1-3 1秒パルスの範囲を用いて、超音波処理している以外は前と同じ超音波パラメータを使用すると、評価するXTTキットの損傷の範囲を開発するために1秒間隔を置いて配置しました。 注：これらの手順の多くは、XTTキットのマニュアルから直接取得され、唯一の興味研究所の便宜のために繰り返されます。 </li><li> 10分間200×gで遠心分離することによって細胞を収集します。前述した増殖培地中で細胞ペレットを再懸濁します。約1×10 5細胞/ mlで再懸濁細胞。ウェルを三連で平底96ウェルマイクロタイタープレートに当たり100μlの種子におけるU937細胞を、次いで、別個の96ウェルプレートを使用してTHP1細胞について繰り返します。ブランク吸光度の測定値として単独で完全増殖培地100μlを含む3対照ウェルを含みます。その後、2のために接種したプレートをインキュベート4時間。 </li><li> XTT試薬および使用前に37℃での活性化試薬の2つのアリコートを解凍。透明な溶液が得られるまで穏やかにアリコートを旋回。 XTT試薬5.0 mlの活性化試薬を0.1mlを加え、1枚の96ウェルマイクロタイタープレートアッセイのための十分な活性化XTT溶液を形成します。他のプレートのためのプロセスを繰り返します。 </li><li>各ウェルに活性化 - XTT溶液50μlを追加します。 2時間の細胞培養CO 2のインキュベーターにプレートを返します。静かに均等に陽性ウェルにオレンジ色を配布するインキュベーション期間の後、プレートを振ります。マイクロタイタープレートリーダーを用いて450〜500 nmの波長の間の波長で細胞を含有するアッセイウェルおよびブランクバックグラウンド対照ウェルの吸光度を測定します。 </li><li>いずれのブランク対照ウェルを用いてマイクロタイタープレートリーダーをゼロまたは特定の結果から、その平均値を減算します。 wavelengで再びすべてのアッセイウェルの吸光度を測定します第630から690 nmの間で得られた450〜nmの値から値を減算します。注：この第二の吸光度決意は、アッセイの結果から、非特異的な測定値を排除するのに役立ちます。 XTTアッセイは、両方の細胞株について4回繰り返しました。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

最適な結果を達成するために、特別なケアは慎重にサンプルを配置し、コンバータ·ホーン組合をきれいにするために取られるべきです。ホーンのサンプルの配置は、ホーンからの距離を変更すると、音響焦点を変化させ、したがって、サンプルがさらされるエネルギーを変化させるように、一貫性の細胞破壊を得るために重要です。カップホーン内の音響エネルギーは、最大キャビテーションの位置を見つけるために、キャビテーションメーターを用いてマッピングすることができます。また、キャビテーションメーター、オシロスコープと一緒に細胞がさらされている音の強さを決定するために不可欠であるだけでなく、波形の均一性。したがって、これらの機器は、システムに問題を検出し、トラブルシューティングは、システムの不安定性を修正するために必要とされるかもしれないものを判断するために使用されるべきです。 前述のように、低周波数システムは、実験を通して、さらに脱ガスに水を作用していない場合のために実行することができます超音波処理をサンプリングする前に数分。この最初の実行では、実験中に比較的脱気した超音波処理媒体ため、一貫性のある結果を得るために行われなければなりません。 sonosensitizersの有効性を評価する際の感作の真の程度が評価するのは困難であるように加えて、細胞は、最大振幅またはその近くで超音波処理されるべきではありません。 40 kHzのシステム上で33％の振幅を使用すると、それが顕著な損傷を生成するように、理想的な設定ですが、U937及びTHP1細胞（ 図7）に対してMeβCDで示されたように、その有効性を実証するためにsonosensitizers十分な余地を提供します。これらのデータはまたMeβCDが用量依存的に低周波の超音波の多重白血病株を感作することを確認します。 超音波処理17-19を介して生成された膜内キャビテーション気泡の証拠を示す8 MHzに0.75メガヘルツの範囲でより高い周波数で行われた実験の数がありました。しかし、questioまだ超音波によって誘導される細胞溶解18の正確なメカニズムに関しては残るNS。我々は細胞骨格を流動化し、低周波超音波15、他の研究室20,21によって実証現象を利用して音波の感度を増加させたとの間のリンクを示している。また、我々は、サイトカラシンBのようなマイクロフィラメント、破壊剤は、複数の白血病での超音波の感度を増強することを発見しましたアクチン重合の阻害を示唆する線ではなく、hHSCsまたは22の白血球は、特に関心のsonosensitizing機構であってもよいです。またビンクリスチン、チューブリン重合を阻害する23微小管破壊剤、24は 、顕著に急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病を含む、 インビトロでの異なるタイプの白血病の超音波感受性を増加させることを観察しました。これとは対照的に、細胞骨格成分を安定化させる細胞骨格指向剤（パクリタキセルANDのジャスプラキノリド）は、細胞溶解22の下率で反射された、超音波処理に細胞が耐性にするように見えます。まとめると、これらのデータは、腫瘍細胞の細胞骨格成分を流動化することは、実際にSDT 25の効率を向上させる上で重要な因子であるという仮説を支持します。本研究はまた、コレステロール枯渇はMeβCD処理したU937細胞が著しく40 kHzの超音波に感作されているように、さらに、新生物細胞の超音波感受性を増強するすることにより、別の方法であってもよいことを示しています。 当社の超音波処理プロトコルは、in vitroで顕著な抗新生物活性を示しているが、現在の方法論は、文化や超音波処理のために使用バイアルに適合することができる小型の脊椎動物のモデルで動作するように制限されています。我々は、安全に、パルスの低周波超音波（20キロヘルツ）を用いて超音波処理することができることを示しているゼブラフィッシュ、および化学療法剤に対する耐性は、定量的に同等であることを担癌ゼブラフィッシュは、これらのプロトコルのインビボ抗腫瘍活性を評価する予備研究において使用され得ることを示唆しているマウスモデル26によって許容用量。それにもかかわらず、前の哺乳動物モデルの超音波処理に化学療法剤を投与するMHzの範囲1に報告されており、このようなプロトコルは、おそらく、低周波超音波、ならびにコレステロール枯渇および細胞骨格指向剤を組み込むように拡張することができます。 SDTのこの形式の潜在的な臨床応用は、従来の超音波処理25のために除去された血液に（iv）の抗腫瘍剤を静脈内に投与された体外血液超音波処理を含むことができます。この方法は、人体の解剖学的構造によってもたらされる潜在的な音の障壁を除去し、固形腫瘍から白血病性芽球、ならびに転移を損傷する効果的な方法かもしれません。これは、コレステロール枯渇および細胞骨格指向剤は可能性もあります既にこの治療法の有効性を改善する試みにおいて、臨床において検討されているHIFUプロトコルにおいて使用されます。 本研究に記載された方法は、潜在的なsonosensitizersの価値を評価することが可能で、さらにシステムの改良は、このユーティリティを高めることができます。しかし、電源品質、音響焦点、およびコンバータの個体ばらつきを含む超音波クレビスを使用する際に考慮すべき多くの変数があります。そのため、今後の研究は音波を可視化し、その結果に及ぼす影響を理解することに焦点を当てます。 SDTは、 インビトロで細胞溶解を増強することが示されており、哺乳動物モデルにおけるインビボでの多くのデータが取得された場合、臨床的に実行可能なことが判明し得ます。複数のエージェントおよび超音波を伴う悪性細胞の他の潜在的に悪用可能な特性、ならびに種々の複合モダリティを調べる実験では、我々の研究室で継続します。

超音波は、人間の聴覚能力（〜20キロヘルツ）1の上限値よりも高い周波数を有する任意の振動音圧の波を指します。 20〜60 kHzの範囲の低周波の超音波は、核酸抽出のため、組織破壊のため、および他の試験の様々な細胞のサンプルを調製し、エマルションを生成する手段として研究室で利用されています。低周波超音波のユーティリティは、様々な材料を洗浄、溶接のための工業環境に拡張し、材料加工に採用されています。市販の超音波発生器は100-1,200 Wからワット数を18〜60 kHzの範囲の周波数に来て、フルスケール超音波は、長い画像診断のための臨床設定で使用されてきたが、それはごく最近の治療法として適用されています。超音波≥1MHzのは、安全に目に尿路結石（腎臓結石）と胆管結石（石を破壊することが可能です症状2,3を減らすために、患者の電子の胆嚢や肝臓で）。体外衝撃波砕石術（ESWL）と呼ばれるこの手法は、現在広くクリニック（百万人以上の患者が米国だけでESWLで毎年4に処理されます）に適用され、モダリティを提供していますそれによって非侵襲的に結石を破壊され、外部から印加され、集中し、高強度の音響パルス2-4を使用することにより、最小限の付随的な損傷。 これにより、高強度の超音波によって生成される一意の直接剪断力、ならびにキャビテーション気泡に、これらの方法は、高強度として知られている手法では去勢抵抗性前立腺癌および膵臓腺癌の治療のための癌治療において検討されているが、集束超音波（HIFU ）5-8。 ESWLと非常に類似した方法では、HIFUは、複数の超音波ビームを使用し、60°CまたはHIGの温度を生成するために、選択された焦点領域上に焦点を合わせます標的組織5で凝固壊死を誘導する音響エネルギーの使用を介して彼女の、。熱アブレーションの他のモダリティは、現在（高周波アブレーションおよびマイクロ波切除）が存在するが、HIFUは、それが唯一の非侵襲性の高体温モダリティ5であることを、これらの方法に比べて明らかな利点を提供しています。 HIFUは、診療所での混合の結果を達成し、現在臨床試験8-11でのみ使用することができました。それにもかかわらず、限られた成功は、それを実現しており、前臨床モデル哺乳動物から取得された生体内データにおける非常に有望な癌治療における超音波の可能性を実証しました。 HIFUを改善するために、研究者はsonochemotherapyのフォームを生成するために、適切な抗悪性腫瘍剤で超音波を結合しようとしました。音響化学療法（SDT）は、インビトロでの印象的な抗新生物活性を示した有望な新規な治療法であり、 <em&gt; in vivo試験1。そのような細胞および正常組織学的1,5のものとの間のサイズの差に基づいて、優先的に悪性細胞損傷を、その超音波が示されています。 SDTは、腫瘍細胞に対して、超音波によって及ぼさ優先損傷の程度を増加させるためのsonosensitizersとして知られる特殊な薬剤を搭載しています。 SDTの治療用途は、以前に検討されているが、使用される超音波システムは、典型的には、より高い周波数の超音波（≥1MHz）を採用し、低kHzの周波数の超音波の効果はまだ十分に探求されなければなりません。超音波の周波数が低い慣性キャビテーション、物理化学的ダメージ12-14の誘導、マイクロバブルの急速な崩壊に起因する細胞の破壊をもたらす現象を生産で多くの場合、より精通しています。 MHzおよび低kHzの超音波との間の慣性キャビテーションの発生の差が低い波周波数はマイクロバブルを有効にするという事実に起因していますその結果、以下の圧縮半サイクル12の間に、より暴力的な崩壊を生成する、拡張半サイクルにおいて整流拡散によって成長する多くの時間です。 我々は以前U937ヒト単球性白血病細胞は、低周波超音波（23.5キロヘルツ）に敏感であり、この感度は著しく細胞骨格15を乱す抗腫瘍剤を適用することにより増加させることができることを示しています。さらに、我々は、大きなセルは、より高い音波感受性を示すと、細胞が優先的サイズに基づいて、破損していることを実証しました。加えて、同程度の細胞サイズで正常なヒト造血幹細胞（hHSCs）および白血球仮低周波超音波を優先正常組織の存在下で悪性細胞を損傷するために使用され得ることを示唆し、その新生物の対応15より超音波処理に非常に耐性が高いです。 さらにユニークな小道具を調べるために、潜在的な治療に使用するための低周波超音波のertiesは、我々は、我々の現在の超音波処理システムのいずれかの有効性と信頼性を高めるために取り付けられた20ミリメートルのホーンを搭載したブランソンモデルSLPe 150 W、40 kHzの細胞破砕を、洗浄および安定化手順を開発しました7.62センチメートルカップに。さらに、我々はハイドロホンとキャビテーションメーターとオシロスコープを使用して、40 kHzの範囲内で正確なサンプルキャビテーションエネルギーだけでなく、一貫性のある波形と振幅を決定することができました。精錬と私たちのプロトコルを体系によって、我々は、私たちは定量的に異なるhistogenetic系統の腫瘍性および正常細胞の音波感度を比較することができ、我々の実験超音波処理の一貫性を確立することができました。 40 kHzのシステムのための我々のプロトコルは、関心のある研究室は、同程度の実験を行うことができるように、および抗腫瘍によって誘発効果の調査結果を評価するために広範に詳細に示されています低周波超音波。 （; 図1MeβCD）、コレステロール除去剤、U937の超音波感受性およびTHP1ヒト単球性白血病細胞を増加させることに加えて、我々はメチルβシクロデキストリンの用量依存的効果を調べます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium w/ NaHCO3 &#38; 25mM Hepes&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100x Solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3&#34; (25mm) Cuphorn</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>101-063-726</td>
			<td>sonication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater</td>
			<td>Brisk Heat</td>
			<td>SDCJF1A-GBH1000-1</td>
			<td>heater used for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp&#174; Software</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>6605700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 50mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL &#38; 25mL Vented Culture Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>&#160;A35473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuJet Pro Auto Pipet&#160;</td>
			<td>BrandTech Scientific</td>
			<td>26330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1840, 1126-7810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100uL Micropipette&#160;</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>851164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000uL Micropipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>851168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Dual Chamber Counting Slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tektronix&#160; DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>DPO2002B</td>
			<td>used to measure the ultrasonic waveform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter</td>
			<td>PPB Megasonics</td>
			<td>PB-500&#160;</td>
			<td>used to assess the sound intensity in W/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone</td>
			<td>Teledyne</td>
			<td>TC4013-1&#160;</td>
			<td>connects to the oscilloscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 250mL Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z364827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Glass Scintillation Vials&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>diluent for Z2 counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof Anhydrous&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-1011K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Microplate Reader</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>&#160;EW-13055-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 Human Monocytic Leukemia Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL&#173;1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP1 Human Monocytic Leukemia Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and quantitative analysis of pulsed low frequency ultrasound to determine the sonic sensitivity of untreated and treated neoplastic cells

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.

システムの安定性は、反復可能で信頼性の高い結果を得るために非常に重要です。 54.23 N、Mの適切なトルク値は、 図3Bは、サンプルバイアルの内部測定値を示している。波形の整合性をオシロスコープとハイドロホン（ 図3A）を使用することによって評価されると、変換器とソノトロード2の適切な結合を達成し、かつ図3Cは、カップホーン内の安定性を評価します。予想されるように、振幅がわずかによりガラスに吸収されるエネルギーの一部に減少しました。しかし、波形が乱さまたはサンプルに音波エネルギーを確実に配信するために必要ないずれかのパネルBまたはCに歪んでいませんでした。明確な特異正弦波として表示されません波形は障害のあるトランスデューサまたは不適切なセットアップを示しています。これは、複数の異常な波を示し、図3D、正弦波の明確な非存在下で発現され、かつ周波数がない読書しますtが適切​​に機能してシステムに期待します。 （ 図4）生成されたキャビテーションエネルギーを測定するために使用されるキャビテーションメーターは33％の振幅で100〜110 W / cm 2となるように音の強さを発見し、そして50％の振幅で、125〜130 W / cm 2です。 40 kHzのシステムが適切に較正され、その全体（ 図5）に組み立てた後の両方TC20及びZ2のカウンタ（ 図6）によって決定されるように、信頼性の細胞破壊が容易に達成されました。予想されるように、より広範な細胞損傷ではなく、33％の振幅に比べて、50％で超音波処理した細胞集団で観察されました。それにもかかわらず、33％の振幅は、それが顕著な被害を生じさせるように、投与された薬剤の潜在的な音波増感効果を検出するための出発点として有用であるが、薬剤は、超音波感受性のそれらの増強を評価するために適用されるときに、より損傷を検出するための余地があります。これは、 図7Aに示されていますU937細胞の超音波感受性を増強する上でMeβCDの用量依存的効果が示されています。非超音波処理MeβCD処理細胞は、非超音波処理し、未処理細胞の生存率は非常に類似していたが、生存率は顕著に40 kHzの超音波を印加した1秒の3つのパルスの後に低下しました。また、超音波処理後の生存率の低下は、5 mMのMeβCD最大1 mMのに続いて、細胞数の減少、およびその後0.5 mMのMeβCDを製造したように、用量依存性であったと思われます。 XTTキット（ 図7B）を用いて評価されるように、細胞の生存率およびミトコンドリアの活性に類似の効果は、超音波処理の前にMeβCD種々の濃度で処理した両方のU937及びTHP1細胞で観察されました。 THP1細胞は、U937細胞よりも耐性がやや音波であるように見えるが、両方のヒト白血病株は、用量依存的に損傷を受けます。 MeβCDの高い濃度と超音波PRODの複数のパルス細胞の生存率およびミトコンドリア活性を低下させるために、対応する、U937及びTHP1細胞の両方のための可溶性、鮮やかな色のオレンジ誘導体にXTTの最低削減をuced。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig1.jpg" /> メチルβシクロデキストリンの図1の分子構造。（A）メチルβシクロデキストリン（MeβCD）の完全な構造。 （B）MeβCDはHまたはCH 3のいずれかのR基を有する7繰り返し単位のポリマーです。分子式：C 56 H 98 O 35。分子量= 1331.36。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig2.jpg" /> 図2.適切に40 kHzの超音波システムをトルク締め。（A）ホーンとコンバータはカップpriから削除されますまたはトルク締めします。 （B）それぞれの位置にあるスロットレンチとトルクレンチを置きます。 （C）カップにホーンと、コンバータを再接続する前に、時計回りの方向のトルクの54.23 N。Mを適用します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig3.jpg" /> 超音波システムの波形を特徴づけるために、オシロスコープの3.図 。 （A）ハイドロフォンと、オシロスコープは、振幅、波形の整合性を評価するために使用することができます。 （B）の記録を1.5 -1で直接ホーンの上にカップに取り、33％の振幅で設定します。 （C）ここで描か波形は、ハイドロホンを20mlガラスシンチレーションバイアル内に配置されたときに取得された読み取りです。バイアルは、上記ホーン1.5センチメートルに配置し、再び33％の振幅に設定されています。 （D）オシロスコープのスクリーンショットO障害が発生したシステムやホーンコンバータ組合の不適切な結合で予想されるように、異常な周波数とFAシステム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig4.jpg" /> 超音波システムの音の強さを特徴付けるキャビテーションメーター図4.。ここに見られるキャビテーション計はW / cm 2の中にキャビテーションエネルギーを表すために使用されます。これは、サンプルに対するエネルギーの一貫性を評価するための非常に重要な手段です。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig5.jpg" /> 40 kHzの超音波システムの図5.主な構成要素は、超音波システムは、カップホーンを備えた示されています（ <stroNG&gt; A）、加熱装置（B）、コンバータ（C）、及び試料位置決め機構（D）。この設計は、ホーン（F）上記のサンプル（E）の容易な位置決めを可能にします。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig6.jpg" /> TC20及びZ2のカウンタを使用してU937細胞を超音波溶解に対する振幅の異なるレベルの図6の効果 。細胞を、それぞれの間で1秒間隔で、超音波の三1秒パルスを用いて33％の振幅で40 kHzのセル除膜器（dismembrator）（100〜110 W / cm 2）を50％の振幅（125〜130 W / cm 2）を用いて超音波処理しました。これらのパルスの。 Z2カウンタソフトウェアから（A）のスクリーンショットは、U937細胞に対する超音波処理の効果を示します。 TC20カウンタから（B）のデータは、結果の再現性を実証するために、グラフにまとめました秒。これらのデータは、合計して、生細胞数、ならびにトリパンブルーは、細胞生存率を評価した含まれています。バーは4つの独立した細胞集団の平均の標準誤差（SEM）を反映している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig7.jpg" /> U937及びTHP1細胞の超音波感受性を増強する上でメチルβシクロデキストリンの図7.影響。（A）U937細胞は、従来の40kHzの超音波（105 W / cm 2の超音波処理されることに30分間MeβCD種々の濃度で処理しました）は、3つの1秒パルスを使用して、離れて1秒間隔をあけ。細胞集団は≥12ミクロンと≥17ミクロンに分類しました。 （B）U937またはTHP1細胞が再び変化するコンセントで処理しました30分間の前に1秒の超音波の1-3パルスを使用して40 kHzのシステムで超音波処理されることにMeβCDの配給は1秒間隔を置いて配置しました。細胞の生存率およびミトコンドリア活性は、XTTキットで評価しました。細胞100μlを、平底96ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり播種しました。プレートは、従来のXTT溶液の添加を24時間インキュベートしました。波長を読み取る前に、細胞を、次いでさらに2時間インキュベートしました。バーは、4つの独立した細胞集団のためにSEMを反映している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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