Name: a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans
Uploaded: 2015-10-16T14:00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans at JoVE.com

The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

OBS: Utför alla steg under sterila betingelser (skåp med laminärt flöde) och med försteriliserade material (genom autoklavering 126 ° C, 11 min). En LB-platta med ströks ut E. coli OP50 hölls vid 4 ° C krävs, strimma ut på färska LB-plattor och restreak varje månad. 1. Bakteriell Food (Escherichia coli OP50) Framställning <ol><li> Dag 1. Inokulera 2 x 5 ml LB i två universella flaskor med en enda koloni av E. coli OP50 och placera i skakinkubator vid 37 ° C (220 rpm) under 8 timmar. </li><li> Efter 8 timmars inkubation, använda 2 ml E. coli OP50 LB-odling för att ympa var och en av 3 x 200 ml LB. Placera kolvarna i skakinkubator (220 varv per minut) O / N (17 h) vid 37 ° C. </li><li> Väg 20 x 50 ml centrifugrör och skriva vikt på röret. </li><li> Dag 2. Med hjälp av en serologisk pipett, portion 30 ml av O / N E. coli OP50 kultur i pre vägde centrifugrör. Centrifugera vid 7,741 xg, 10 ° C, 8 min. </li><li> Försiktigt dekantera supernatanten, hålla röret inverterad med lock och låt stå i flera minuter. Med hjälp av en pipett avlägsna eventuellt överskott supernatant som kan ha samlats i locket. Väg röret och beräkna vikten av pelleten. </li><li> Beräkna volymen som behövs för att åstadkomma en suspension av 30 g / I och markera denna volym på röret. Datum, etikett och placera rören vid -20 ° C för användning inom 1-3 månader eller vid - 80 ° C om förvaring längre än 3 månader. </li><li> Förbered bakteriesuspensionen för att odla nematoder, tillåta bakteriepelleten att tina upp och tillsätt erforderlig volym S fullständigt medium 11,12 till varje rör försiktigt virvel att resuspendera pellets, att samla innehållet i olika rör få den nödvändiga volymen. Arbete under sterila förhållanden. </li></ol> 2. Framställning av Drug Standards i en 96-brunnars plattformat OBS: Om du använder en läkemedelsbiblioteket, är drogplattor anordnade vid en endakoncentration av föreningen i DMSO. Primär screening kommer att testa föreningar vid en enda koncentration. Instruktioner följer för framställning av läkemedel platta för bekräftande förening provning vid ett intervall av koncentrationer mellan 0-160 iM, utvalda efter statistisk signifikans på 10 iM. Stegen nedan kan anpassas för att testa andra koncentrationer. OBS! Följ nödvändiga försiktighetsåtgärder för hantering av läkemedel (vanligtvis ansiktsmask, skyddsglasögon, handskar krävs). <ol><li> Förbered läkemedels platta med arbetsnormer för bekräftande screening: väga erforderliga mängden förening i steril 1,7 ml mikrocentrifugrör och förbereda 16 mM förening i DMSO (dvs, 100x koncentrerad i förhållande till önskad övre koncentration för exponering). </li><li> Seriellt utspädd 16 mM stam 1: 2 i DMSO för erhållande av 8, 4, 2, 1, 0,5 och 0,25 mM standarder (sterila betingelser). Dessa är 100x koncentrerade och kommer att spädas ned till slutliga koncentrationer av 0 (endast bärare),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 och 160 ^ M (i 1% DMSO) under läkemedelsexponering. </li><li> I ett skåp med laminärt flöde, placera 20-50 | il per brunn av sammansatta normer inom en kolonn av en 96-brunnars platta, exempelvis plattan läge A1: 16 mM, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0,25 mM läkemedel och H1: DMSO. Använd olika kolumner för spädningsserie av olika läkemedel. </li><li> Alikvot fordon till brunnarna i kolumn 12 i läkemedelsplattan. OBS: Detta kommer att underlätta testning av kontrollen över fordonet ner kolumner i Utöver den testning längs raden H, se till att fordonet provas i positionerna är representativa för hela plattan. OBS: Varje läkemedel platta för bekräftande screening håller spädningsserie för högst 11 olika läkemedel som ska testas plus vehikelkontroll. </li><li> Etikett och tätningsplattan, täck med folie och plats vid -20 ° C tills de behövdes. </li></ol> 3. nematoder Experiment OBS: Genomför alla steg under sterila betingelser, aseptiskt och med pre steriliserat material och reagens. Behåll C. elegans stammar rutinmässigt på NGM plattor med E. coli OP50. 12 Föreslagna frekvens för de olika protokollstegen tillhandahålls i tabell 1. <ol><li> Dag 1 uppgift: inrätta flytande kultur av biosensor stam för efterföljande synkronisering. <ol><li> Ta upp nematoder från en 6 cm NGM platta (med massor av unga larver där livsmedel bara har tagit slut) i 2 ml S komplett och överföra till kolv med 30 g / L E. coli OP50 i S komplett (total volym 30 ml i en 250 ml volym konisk glaskolv). Inkubera 3 dagar vid 20 ° C, 160 varv per minut. </li></ol></li><li> Dag 4 uppgift (låt ca 30-35 min): blekmedel kultur att skörda ägg och synkronisera masken befolkning. Utför alla centrifugeringssteg under 1 min, 600 x g. <ol><li> Bered blekmedel strax före användning: till varje 16 ml av 0,156 M KOH / NaOH till 4 ml blekmedel. </li><li> Häll 2 x 14 mlmasken kultur i 15 ml koniska centrifugrör. Låt maskar att bosätta av tyngdkraften (3 min). Ta bort och kasta flytande ovan bosatte nematoder. Tillsätt 5 ml blekmedelslösning till varje rör och starta timern. Kombinera volymer in ett rör. </li><li> Vänd röret försiktigt under 2 minuter, kolla under stereoskop för att bryta av maskar och frisläppandet av ägg i suspension. När de flesta ägg släpps eller vid en maximal tid av två minuter i blekningslösningen, centrifug. </li><li> Avlägsna supernatanten försiktigt. Tvätta pellets 1x med 14 ml S fullständig och centrifugera. </li><li> Kassera supernatanten, tillsätt 10 ml blekmedel och starta timern (denna andra blekmedel steg säkerställer att de flesta av masken slaktkroppar upplösas och inte längre ses under stereoskop). Efter en maximal tid i blekmedelslösning av 2 minuter, centrifugera. </li><li> Tvätta pelleten 3x i S komplett försiktigt dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 14 ml S komplett efter varje centrifugering. Efter sista tvätten, återsuspendera ägg pelleten i 14 ml S complete. </li><li> Överför volymen till en konisk glaskolv. Inkubera 18-24 h vid 20 ° C, 160 varv per minut. OBS: Skördas ägg kläcks O / N och arrestera utveckling vid första larv stadiet (L1) på grund av brist på mat, därför kommer de alla vara i samma skede av tillväxt. </li></ol></li><li> Dag 5 uppgift: inrätta synkroniserade masken kulturer för narkotikaanalyser. OBS: Worms suspenderade i svält mediet tenderar att hålla sig till hydrofoba plastytor såsom pipettspetsarna och rör. 0,01% Tween-20 är ett ytaktivt medel som används här för att göra plastytor mer hydrofila och tillåta större tillförlitlighet vid uppräkning (0,01% Triton-X100 kan också användas). När nematoder är i det bakteriella kompletterat medium, inte de brukar hålla sig till plast. <ol><li> Bestäm antalet kläckta L1 är i kolv, hålla kolven på skakplattform (160 rpm). <ol><li> Ta 3x 100 ul prover från kolv (använd en ren spets varje gång) i separata 1,7 ml mikrorör med 900 pl vätska medium 0,01% Tween-20. OBS: Aspire 100 pl prov till den rena spetsen endast en gång. Sedan när dispensering, pipett upp och ner ett par gånger i interpoleringen kompletterat medium för att frigöra några maskar som ansluter sig till toppen. </li><li> Räkna nematoderna i 4x 10 il droppar från varje trefaldigt späd rör. Beräkna medelvärde och uppskatta antalet maskar som föreligger i den koniska glaskolv. </li></ol></li><li> Beräkna volymen av kläckta nematod fjädring som krävs för att inrätta en 2 x 20 ml kultur med 10 nematoder per 10 pl. Öka beräknade volymen med 10% till svars för några efterföljande nematod förlust under centrifugeringssteg. </li><li> Dekantera volym som krävs i 2 x 15 ml centrifugrör (förvägt). Väg rör för att få verklig volym dispens, virvel försiktigt och anpassa sig till rikta volymen genom att ta bort överskottsvolym med en 5 ml pipett (endast den sterila spetsen bör träda i röret). </li><li> Make up volymen till 14 ml med färska S komplett med varh nematoder. Centrifugera (1 min, 600 g). Avlägsna och kassera supernatanten med noga med att inte störa nematoden pelleten. </li><li> Tillsätt 5 ml S komplett med 30 g / L E. coli OP50 till pelleterade nematoder. Överför 5 ml i varje rör till en konisk glaskolv innehållande 15 ml S komplett med 30 g / L E. coli OP50. Anteckna tids nematoder först försedd med mat. </li><li> Skakkolv försiktigt (160 rpm), ta 9 x 10 pl droppar på mikroskopiska objektglas (använda färska tips varje gång) för att räkna nematoder och bekräfta genomsnitt ca 10 (± 2) per 10 | il. </li><li> Placera nematod kolvar i skakinkubator vid 20 ° C, 160 rpm under 42-44 timmar. </li></ol></li><li> Dag 7 uppgift: överförings nematoder till 96 brunnar och påbörja läkemedelsexponering. <ol><li> Kombinera nematod kulturer i en enda kolv, hålla snurra flaskan försiktigt och placera 3 x 4 ml nematoder kultur i en 60 ml steril tråg. Placera tråget på en skakande plattform (160 varv per minut). </li><li> Använd 8 channel pipett att alikvot 25 pl suspenderade nematoder per brunn av 96 väl svarta mikrotiterplattor med en plan transparent botten (för att ta både luminiscens och fluorescens avläsningar, eller vita plattor för luminiscens endast). Täck med platta lock och ställ åt sidan. <ol><li> Efter installation av varje 2 plattor, placera ytterligare 2 x 2,5 ml nematoder i tråget för att ersätta förlorad volym (hålla en &quot;död volym&quot; i tråg av ca 7 ml). </li><li> Inrätta 13/14 plattor med nematoder. 11 nematod plattor kommer att krävas för att testa två 96-well läkemedelsplattor. Den 12: e nematod plattan kommer att laddas enbart med vehikel som kontroll. Den 13: e platta kommer att användas för att fastställa bakgrundsfluorescens på dag 8 (se nedan). En extra platta kan framställas för användning bör misstag inträffar under uppsättningen. </li></ol></li><li> Alikvotera 74 il S komplett till varje brunn och placera plattan i en fuktig kammare (se materiallista) i en skakinkubator (20 ° C, 160 rpm) until redo att portion testföreningar vid förvald utvecklingstiden (t.ex. 45 tim 30 min efter livsmedel som tillhandahålls). [Volym per brunn är nu 99 pl]. </li><li> Tina upp drog skylt (ar) för att testa. </li><li> Använd flerkanalspipett att inrätta nematod plattor med läkemedel, ändra tips varje gång. Tillåt 5 minuter per 96 brunnar för alikvotering läkemedel. <ol><li> Ta 1 pl från 1: a kolumnen läkemedels plattan och lägg till kolumnerna 1-5 i en platta innehållande nematoder; upprepa från 2: a kolumnen i läkemedelsplattan i kolumner 8-12 av plattan innehåller nematoder. Tillsätt 1 pl av fordonet till kolumnerna 6 och 7 av nematoden plattan. OBS: Den totala volymen per brunn i nematoden plattan kommer att vara 100 | j, l som resulterar i en 1: 100 spädning av förening / vehikel. </li><li> Upprepa processen genom att tillsätta 1 pl av 3: e / 4: e kolumnen i läkemedelsplattan kolumnerna 1-5 / 8-12 på den andra nematoder plattan; lägg fordon kolumnerna 6 och 7 i nematoden plattan.</li><li> Fortsätt att testa återstående läkemedelsplatt kolumner. Inrätta minst en nematod platta med fordonet i alla brunnar genom provtagning från kolonn 12 av läkemedelsplattan. Placera plattorna tillbaka i fuktiga kammare i skakinkubator (20 ° C, 160 rpm) under 20-22 timmar (se not för dag 8). </li></ol></li><li> Del-förbereda luminiscens buffert för nästa dag: add DMSO och 10% Triton-X-100 till den erforderliga volymen av S fullständig för att erhålla en% DMSO och 0,15% Triton X-100. Låt 5 ml per platta läsa för luminiscens, plus 1 ml för priming luminometer injektor. </li></ol></li><li> Dag 8 uppgift: Läs experimentella endpoints - fluorescens och mareld. (GFP-fluorescens avläsningar rekommenderas som ett medel för att normalisera bioluminescence data.) OBS: Sikta på att läsa endpoints med 66-67 timmar efter måltid tillhandahålls nematoder för att förhindra betydande avkomma produktion under de experimentella förhållanden som beskrivs. <ol><li> Ställ upp plattan att använda som bakgrundskontroll för GFP avläsningar. Combine väl innehåll från 13: e platta till en 15 ml rör. Låt nematoder att bosätta sig (2-3 min). Använd supernatanten att ladda en mikro (svart med transparent botten) med 100 ul bakteriesuspension per brunn. <ol><li> Observera bakgrundskontroll plattan under mikroskop anteckna brunnar där nematoder kan ses. Uteslut dessa från bakgrunden uppskattning som används i efterföljande dataanalys. </li></ol></li><li> Läs fluorescens av varje 96-brunnsplatta, inklusive bakgrundskontroll. (Inställningar: optik från botten av plattan, filter 485/20 excitation, 528/20 emission.) </li><li> Förbered buffert för luminiscens avläsningar: lägg luciferin (20 mM) till del förberedd buffert (från föregående dag), för att erhålla luminiscens buffert med 1% DMSO (1x), 0,15% Triton-X100 (3x) och 0,3 mM luciferin (3x ). Prime luminometer injektor 6x med 150 | il luminiscens buffert. <ol><li> Föregående steg förutsätter 1% DMSO som fordonet under läkemedelsexponering. När fordonet är vatten, justera concentration DMSO i luminiscens buffert till 3% (dvs 3x). </li></ol></li><li> Arbete med en platta i taget. Fördela 50 ^ luminiscens buffert per brunn. (150 pl slutlig volym i väl, 3x utspädning av luminiscens buffert: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 och 0,1 mM luciferin slutkoncentrationer.) Placera omedelbart på skakplattform och starta timern. <ol><li> Efter 3 min på skakplattform (160 rpm), läs luminiscens (1 sek per mätning). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Dataanalys <ol><li> Subtrahera genomsnittliga GFP bakgrunden läsning från fluorescensresultat. Dividera bioluminiscens av respektive GFP läsning. <ol><li> När en hög GFP värde detekteras för nematoder exponeras för en förening, mäta fluorescens av föreningen på egen hand för att svara för vilken som helst förening fluorescens. Om högre än genomsnittet, använda detta som bakgrund i stället. </li></ol></li><li> Express bioluminiscens, GFP normaliserade mareld ennd GFP fluorescensdata som andel av det genomsnittliga värdet för fordonskontroll i varje platta. </li><li> Rita medelvärden och felstaplar för varje koncentration. </li><li> Test för statistisk signifikans med hjälp av 2-vägs variansanalys (ANOVA) med effekterna av &quot;Koncentration&quot;, &quot;Experiment&quot; och deras interaktion (varje datapunkt hänvisar till en enda brunn), och använd Dunnett testet som post-hoc test (vs . vehikelkontroll). OBS: Om &quot;experiment&quot; eller &quot;interaktion&quot; termer är betydande, kan ytterligare experiment behövs för att bekräfta svaret. Om ingen variation mellan experiment framgår av observation av data tomter, kan en One-way ANOVA utföras på poolade data från oberoende experiment. <ol><li> För den statistiska analysen av skylt (ar) med enda fordon, markera alla brunnar i kolumnerna 6 -7 och alla brunnar i rad H som kontrollgruppen (dessa är positionerna rutinmässigt tilldelats fordonet under förening testning). </li&gt; </ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+phenotypic+gap:+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7 (2008).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans,+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor.">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li><li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor.">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503 (2012).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells.">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li><li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+the+Crabtree+effect:+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants.">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li><li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tobacco-specific+nitrosamine+4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone+(NNK)+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content,+transcription,+ATP+production,+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans.">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).</li><li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism.">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li><li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors.">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases.">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li><li>Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).</li><li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+in+chemical+biology:+a+compendium+of+inhibitors,+mechanistic+evaluation+of+chemotypes,+and+suggested+use+as+a+reporter.">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li><li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism.">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li><li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function.">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li><li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development.">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li><li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans.">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li><li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development.">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li><li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods.">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877 (2013).</li><li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7,+two+major+components+of+the+hypodermis.">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li><li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut

Den modellorganism C. elegans ger en kraftfull experimentella system. Det är lätt att odla och producerar rikligt genetiskt identisk avkomma med en 3,5 dag livscykel från ägg till reproducera vuxen (via ungdomslarvstadier L1 fram till L4). På grund av sin ringa storlek, kan det vara enkelt odlas i 96-brunnsplattor, vilket underlättar förening screening. Vi presenterar en fenotypisk screening protokoll baserat på stammar av C. elegans som fungerar som in vivo sensorer av energinivåer. 14 Protokollet är tillämplig på alla laboratorier, även om en 96-brunnar luminometer och en steril skåp krävs. Det är viktigt att förhindra förorening i analyser med hjälp av god laboratorieteknik. Om att arbeta manuellt, är det maximala antalet nematod plattor uppnås 13 per experiment tillåter testning av 2x 96-well drogplattor och med två fordonsplattor. Representativa resultat presenteras för mitokondriekomplex I-inhibitor rotenone, superoxidgeneratorn parakvat, citronsyracykeln mellanliggande oxalacetat och fyra föreningar med känd eldflugeluciferas inhiberande aktivitet. De första två föreningarna ledde till en minskning i bioluminescens som förutspått medan oxaloacetat ledde till en förbättring, troligen att resultera från ökad generering av ATP. Oxalacetat datamängder visar också den inneboende variabiliteten i experiment baserade på eldflugeluciferas som reporter. Ett minimum av tre oberoende försök är tillrådligt att fastställa robusthet svar på okända föreningar. Inhibering av firefly luciferasaktivitet var identifierbar med en analys in vitro med användning av ett kommersiellt kit. 3 En av föreningarna resulterade i en väsentlig ökning av GFP-fluorescens i överensstämmelse med inhibitorn öka nivåerna av GFP-märkta eldflugeluciferas genom bindning till luciferas enzymets aktiva plats, och gör den mer stabil. 15 I vissa fall(inte i det här fallet) kan detta leda till ökade nivåer av mareld när hämmaren förskjuts av överskott substrat. 15 Det är därför viktigt att inte tolka resultat felaktigt från föreningar som interagerar med eldfluga enzymet som minskad eller ökad ATP-halter / mitokondriefunktion. Förändringar i luminiscens signal korrelerar ganska ofta med ytterligare mätningar av hälsa, såsom rörelse, utveckling och tillväxt. Som ett exempel, är en förening en misstänkt luciferas inhibitor om en dramatisk nedgång i mareld signal upptäcks, men maskar inte kan skiljas från kontroller mikroskopisk observation. En ökning av GFP fluorescens, inte förklaras av tillväxt eller förening autofluorescens, kan också peka på en inhibitor. Ett antal luciferas inhibitorer 15 är kända och har ingåtts PubChem. Därför i första hand, är det god praxis att hämta information luciferas hämmare som innehas av PubChem; följt av tEsting av föreningens effekter i in vitro-analyser med det renade enzymet 3 och / eller bekräftelse av effekter på mitokondriefunktionen genom att ytterligare medel. 16,17 GFP fluorescensmätningar gör det möjligt att upptäcka eldflugeluciferas nivåer (och potentiella detektering av vissa luciferas enzymhämmare såsom diskuterats ovan) gör ett starkt argument för att mäta denna endpoint tillsammans bioluminiscens där så är möjligt. Normalisering av mareld avläsningar till GFP är också ett sätt att redovisa variationer i snäck tal mellan brunnar (även om detta också kan uppnås genom införande av flera tekniska replikat). För större känslighet, är det viktigt att subtrahera bakgrundsfluorescens från mätningarna. Protokollet bedömer bidrag av den bakteriella suspensionen till bakgrundsfluorescens emellertid nematod autofluorescens redovisas inte för (en begränsning av den aktuella analysen, särskilt kritisk för någon åldrande studör med tanke på att nematod autofluorescens ökar med åldern). Autofluorescens av testföreningar bör också bedömas parallellt. GFP normalisering verkar oumbärlig där forskare vill anpassa protokoll för att jämföra cellulära ATP-sammanslagningar i olika genetiska mutanter eller efter tysta olika gener, för att kontrollera eventuella stamskillnader på nivån av uttryck av mareld transgen. Kritiska parametrar i protokollet innefattar utvecklingsstadiet då exponering initieras, exponeringens varaktighet, och erhålla liknande antal nematoder i olika brunnar. Exponering kan börja när som helst under utvecklingen av nematoder, men L3 scen eller äldre är att föredra. Från detta stadium, nematoder är beroende av oxidativ fosforylering för utveckling i vuxen ålder, vilket framgår av en mycket kraftig ökning i mtDNA innehåll, syreförbrukning och ATP-nivåer. 18,19,20 Den nuvarande protokollet initierar mässorure på L4 scenen. Anledningen till alikvotering nematoder till 96-brunnsplattor endast i detta skede (snarare än när de först försedd med mat på L1 stadiet), är att även om plattorna placeras i fuktiga kammare för att minimera avdunstning sker en viss avdunstning fortfarande i vår skakinkubator, ses som mycket små droppar bildas på locken (detta kan inte vara ett problem med andra skakar inkubatorer). Genom att alikvotering nematoder till plattor strax före tillsats av läkemedelsstandarder, är den faktiska läkemedelskoncentrationen påverkas inte av någon liten variation i volym på grund av avdunstning. Laddning av en nematod platta med fordon är endast användbar för att kontrollera att nematoder jämnt fördelade mellan brunnar. Eventuella signifikanta skillnader hittades för fordonet endast plattan skulle tyda på dålig teknik vid utmatning nematoderna till brunnarna. Längden på exponeringen är en viktig faktor att beakta. Om effekterna på energistatus oberoende tillväxt är av intresse, proprotokoll kan modifieras för att rymma kortare exponeringar (från nästan omedelbara svar på, till exempel, 2 tim). Å andra sidan, införandet av föreningar i C. elegans vävnader kan ta lite tid. Till exempel 12-24 timmar krävs för att uppnå maximal inre koncentrationer av resveratrol och 5-fluor-2&#39;-deoxiuridin (FUDR). 21 Därför kan en längre exponeringstid (18 till 24 timmar) vara motiverat att maximera exponeringsnivåer. Exponeringstiden bör begränsas till tider som inte tillåter signifikanta nivåer av mångfaldigande skall ske i brunnen. Vi rekommenderar att den totala utvecklingstiden för nematoder hålls under 66-67 timmar. Även bekvämt, är nematoder gravid då och har inlett egglaying. Ändå fann vi mareld avläsningar från ägg förberedelser för att vara försumbar (ej visad). Den sur-5 promotorn driven transgen expression först upptäcktes bara två till två och en halv timme efter befruktningen vid 100 cellstadiet 22 och chitinous äggskal är sannolikt att begränsa införsel av luciferin. Andra har funnit att embryonerade ägg inte signifikant bidrar till metabolismen av gravida vuxna. 23 emellertid villkor som möjliggör betydande avkommor produktion ska kunna undvikas. Om du vill kan den experimentella tidsskala flyttas tillbaka: vi har tidigare inlett exponering för en miljögift i slutet L3 larvstadiet (36 timmar) och genomförde mareld och GFP mätningar vid 55 h 2 Alternativt genetiska bakgrunder som är villkorligt sterilt. kan användas för att förhindra avkomma produktion, såsom till exempel den fer-15 (b16) II; FEM-1 (hc17) IV dubbel mutant som kan hållas vid 15 ° C, men är steril vid 25 ° C. 24 Användningen av FUDR att inducera sterilitet rekommenderas inte, eftersom detta kan i sig påverka nematod metabolism. 25 Analysen kan även utföras i stammar med mer genomträngnagelband såsom partiell förlust av funktionsion buss 8 mutanter som är multi känsliga på grund av ökad permeabilitet av läkemedel. 26 Detta kommer att underlätta kortare exponeringar och lägre föreningskoncentrationer. Villkoren för att lägga luciferin till dessa nematoder kan också behöva justera dvs 1% DMSO och 0,05% Triton-X100 i luminiscens bufferten kan inte krävas att förbättra luciferin tillgänglighet. Protokollet använder 1% DMSO som bärare för föreningen leverans. Även om det inte dödlig, denna koncentration av DMSO har några biologiska effekter som vi har diskuterat i en tidigare publikation. 3 Många av de tillgängliga bibliotek läkemedels bereds i 100% DMSO, vid koncentrationer som kommer att vara lämpliga för cellbaserade analyser efter utspädning av fordon till 0,1%. Högre föreningskoncentrationer krävs för att framkalla svar i C. elegans jämfört med mänskliga celler, så att det ofta inte är möjligt att genomföra analyser vid lägre än 1% DMSO. Återigen, användning av stammar medmer genomsläppliga nagelband kan leda till att testa med lägre koncentrationer av fordon. Koncentrationer av DMSO högre än 1% rekommenderas inte. En uppsättning inkubationstid med luciferin före avläsningar ska följas. Som tidigare visats, når luminiscens sina högsta nivåer inom den andra minuten efter att ha lagt luciferin, förblir relativt stabil under de första 5 min, följt av en långsam gradvis minskning av luminiscens under de kommande 30 min 1. Kinetiska svar på en viss kemikalie kan genomföras under detta inledande skede av 30 min efter initial dosering av luciferin. Protokollet innebär en svält steg efter insamling av ägg för att uppnå synkronisering av nematodpopulation. Vi rekommenderar synkronisering av nematod provpopulationer eftersom olika utvecklingsstadier skiljer sig i cellulära ATP-nivåer och kan svara olika på testföreningarna. Genom att utföra svält i S komplettmedellång till skillnad från M9, är kläcknings nematoder försedd med en kolkälla (etanol), så att larverna inte utvecklas, men är inte helt svalt. 27,28 Det har också visat sig att arreste L1: s grundmålas för snabb respons på mat och normal L1 tillväxttakt uppnås inom tre timmar efter måltid blir tillgängliga. 29 det dock möjligheten att svält steget kan förändra metabolismen av C. elegans kan inte uteslutas. 30 Av denna anledning längden av svält bör inte överstiga 24 timmar (18 timmar är tillräckligt för synkronisering). Vissa laboratorier kan ha möjligheten att använda ett Copas Biosorter för ålder synkronisering förbi svält steget helt och hållet. Andra laboratorier kan ha en preferens för att expandera nematodpopulation på fasta medier (NGM plattor med OP50) före blekning (steg 3.1) och detta kommer att fungera bra också. Vi använder S mediet under förening exponering som en standardmedium för nematod odling, however andra medier kan väljas, till exempel K medium eller EPA måttligt hårt vatten används ofta för ekotoxikologiska studier. 31,32 Protokollet ger en möjlighet att screena och identifiera kandidater för ytterligare tester när det gäller effekterna på mitokondriefunktion. Vid tidpunkten för primär screening är det troligt att vissa föreningar kommer att ha missat på grund av endast en koncentration som testas, därför drog skärmar bör inte betraktas som uttömmande. Träffar kan valideras med hjälp av tekniker för att bedöma olika aspekter av mitokondriefunktion till exempel syreförbrukning, C. elegans stammar med GFP uttryck mitokondrier, fläckar för mitokondriell membranpotential och / eller ROS mätningar. 16,33,34 Den största betydelsen av metoden är att ha ett medel för screening av ett stort antal föreningar och / eller förhållandena på flercelliga organismnivå, och framför allt för att kunna dra nytta av the genetisk spårbarhet C. elegans att undersöka verkningsmekanismer. Tekniken kan bidra till att påskynda och hitta nya vägar till upptäckten av intressanta föreningar och mål. Det är tänkt att kombinationen av sensorn med genetisk bakgrund i samband med sjukdom hos människor för screening av substansbibliotek i en sjukdom relevant sammanhang kommer att ha mycket att erbjuda.

Det övergripande syftet med detta förfarande är den snabba kvantifiering av energistatus C. elegans in vivo i syfte att använda detta som en slutpunkt i förening screening. Den logiska grunden är baserad på den transgena expressionen av luciferas från eldfluga i nematoden C. elegans 1-3 via plasmiden pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> Luciferasenzymet fuseras till grönt fluorescerande protein GFP och uttrycks konstitutivt och allmänt utbrett i cytoplasman (luciferas peroxisom målsignal avlägsnades). Detta leder till ljusemission när substratet luciferin tillhandahålls exogent. Eftersom masken är transparent, kan ljus mäts i en luminometer som relativa ljusenheter (RLU). Cellulära ATP bränslen mareld reaktionen och dess tillgänglighet bestämmer ljusnivåer produceras. Därför erbjuder luminometri en convenient betyder att bedöma relativa ATP-nivåer och i förlängningen mitokondriefunktion, eftersom ATP-produktion sker främst i mitokondrier. En länk mellan mitokondriefunktion och mareld nivåer har visats tidigare genom tysta mitokondriella elektrontransport kedjegener och åtföljande minskad ljuseffekt. 1 De mareld stammar som genereras betecknades PE254 (feIs4) och PE255 (feIs5) 1 (se materiallista) och kan användas omväxlande. 3 Ett antal studier har utnyttjat dessa sensor stammar att rapportera om cellulära ATP-nivåer in vivo efter exponering för olika xenobiotiska kemikalier såsom natriumazid 1, kadmium 2, avlopp slamextrakt 3, 5&#39;-fluor-2-deoxiuridin 6, och en tobaksspecifika nitrosamin 7. Stammarna har också varit till nytta för att övervaka effekterna av exponering för ultraviolett strålning C <supp&gt; 8 och effekterna av att störa mitokondriella andningskedjan fungerar. 1,9 En tidig version av luminiscens sensorn uttrycker luciferasgenen utan GFP fusion (PE39) har också använts i utredningen av effekterna av tungmetaller och en respiratorisk . frikopplare 10 Stammarna PE254 och PE255 bär luciferas: GFP fusion och GFP fluorescens visat sig öka proportionellt med nematod massa, som erbjuder ett bekvämt sätt för normalisering av luminiscens värden 6,9 effekterna av olika mängd maskar per brunn kan också vara. beaktas genom att inkludera flera tekniska replikat i analysen (minst 5 brunnar per betingelse). 3 Protokollet ger möjlighet att in vivo övervakning av energinivåer (i motsats till mer tekniskt arbetskrävande in vitro ATP bestämningar) som möjliggör förening screening och flytta i den fysiologiska samband med en hel multicellular organismen. Förfarandet kan förlängas till en mängd olika genetisk bakgrund genom att korsa kromosomalt integrerade transgen i tillgängliga mutantstammar och / eller genom att tysta gener genom RNA-interferens; därmed dra full nytta av C. elegans som modellorganism. Metoden bör bidra till att minska sent misslyckande läkemedelskandidater fas till följd av mitokondriell toxicitet och bidra till minskning av högre djurförsök.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Orion II Microplate Luminometer</td>
			<td>Berthold Detection Systems</td>
			<td></td>
			<td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLx800 fluorimeter&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ks 130 basic shaking platform</td>
			<td>Ika</td>
			<td>#0002980000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4349</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Refrigerated incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with eppendorf rotor A-4-44&#160; (for 50/15ml tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette, Costar</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#4489</td>
			<td>Serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 50 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 15 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile spatula</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3007; #3004</td>
			<td>for weighing out chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mM Millex GP filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well assay plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#3603</td>
			<td>Black plate clear bottom with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 well assay plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#236105</td>
			<td>White plate with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir reagent 60 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Finnpipette</td>
			<td>#9510027</td>
			<td>used as trough for nematodes&#160; in protocol section 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage box/damp chamber</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#10 800 058 001</td>
			<td>174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#239305</td>
			<td>Store in aliquots at 4&#176;C,&#160; seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, potassium salt</td>
			<td>Biotium Inc</td>
			<td># 10101-2</td>
			<td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 &#176;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#317275</td>
			<td>Purity 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#A16046</td>
			<td>Diltute to 10% in ddH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#475914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans bioluminescent strains</td>
			<td>Author&#39;s own laboratory</td>
			<td>PE254, PE255</td>
			<td>contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General chemicals</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

Representativa resultat för att illustrera metoden erhölls för rotenon (Figur 1), parakvat (Figur 2), oxaloacetat (Figur 3), och 4 föreningar som har plockats som eldfluga luciferas-hämmare under screening av en läkemedelsbibliotek 13 (Figur 4). Läkemedlet exponeringen påbörjades vid L4 scenen i samtliga fall, men parakvat exponerings experimenten började vid 41 timmar efter mat först ges till nematoder jämfört med 45-46 timmar för de andra föreningarna. Protokollet tillåter en viss grad av flexibilitet i valet av tidpunkt för inledandet av läkemedelsexponeringen och exponeringslängden. Men för screening, som tider bör följas gång valts, för reproducerbarhet mellan experimenten. Endpoints bör mätas med 66-67 tim utvecklings tid för att förhindra omfattande äggläggning och kläckning av avkomma i brunnar. Riktlinjer för tidsinställningar ges i Tkan ett. Rotenon, en mitokondriell komplex I-inhibitor, minskad mareld efter både relativt korta (2 timmar) och längre exponeringar (24 tim) och ett intervall av koncentrationer (Figur 1). I detta fall gjordes inga GFP mätningar, men antalet tekniska replikat användes (n = 6) är tillräcklig för att utjämna eventuella skillnader i snäck tal mellan brunnarna 3. 24 hr exponeringen är ett fönster av tid under vilken nematoder växer, och långsammare utveckling som ett resultat av komplex I hämning förväntas bidra till nedgången i mareld. Detta bekräftades genom visuell observation under stereoskop med fördröjd utveckling sett, särskilt vid koncentrationer av 20 iM och ovan; Dessutom någon dödlighet noterades från 40 iM (kvalitativa observationer inte kvantifierats). Inga dödsfall observerades efter 2 h exponering, men effekter på snäck rörelse sågs. En kraftig nedgång i mareld i förhållande till kontroller Occurred vid den lägsta koncentrationen av rotenon testade 2,5 iM, för vilka effekter som inte var lätt upptäcks av snabb visuell observation på 2 h exponering. Denna nedgång i bioluminiscens är förenlig med reducerad cellulär ATP. Maximal inhibering uppnåddes med den lägsta koncentrationen av rotenon används (2,5 M) vilket indikerar att alla efterföljande experiment speciellt riktade rotenon bör utföras mellan 0 och 5 iM [koncentrationsområdet 0-160 iM valdes som en del av en jämförelse med andra läkemedel initialt identifierats ha betydande effekter på 10 iM (som ska offentliggöras på annat håll)]. Herbiciden parakvat påverkar mitokondriefunktion genom ökning av reaktiva syreradikaler. Här visar vi dess effekt på bioluminiscens C. elegans-stam PE254 efter exponering för ett intervall av koncentrationer för 24 h (fig 2). Eftersom stammen bär en luc :: GFP fusion, GFP fluorescens var also mätt som ett medel för normalisering. 6,9 Paraquat minskade bioluminiscens, GFP fluorescens och normaliserade bioluminiscens avsevärt. Den Dunnet post hoc-test visade att koncentrationerna av parakvat med betydande skillnader i förhållande till vehikelkontroll var 4 och 8 mM för mareld och normaliserade bioluminiscens, samt 2 mM för normaliserad bioluminiscens. Den enda koncentration avsevärt minska GFP fluorescens var 8 mM, en koncentration vid vilken tillväxteffekter och enstaka döda masken sågs (kvalitativa observationer). Nedgången i bioluminescens (med normaliserad bioluminiscens) var större än den för fluorescens, i överensstämmelse med minskad mitokondriell funktion och effekter på ATP-produktion. Citronsyracykeln mellan oxalacetat testats på C. elegans stam PE254 vid en enda koncentration av 8 mM, ledde till en ökning av mareld (Figur 3). Ingen GFP fluorescerarNCE mätningar erhölls eller ytterligare okulärbesiktning utförs; Men en sådan reaktion på en enda koncentration skulle förtjäna ytterligare bekräftande exponering för en rad koncentrationer, och mer detaljerade observationer av effekter. En förbättring av bioluminiscens av denna förening är inte förvånande eftersom det kan antas leda till ökad aktivitet av citronsyran cyklar, med slutändan ökad produktion av ATP (trots att det skulle vara lämpligt att kontrollera för eventuella effekter på luciferas nivåer genom att bedöma GFP fluorescens i efterföljande experiment). Oxalacetat datamängder visas avslöja graden av variabilitet i svaret ses i luciferas baserade experiment. Enligt vår erfarenhet denna variation är en funktion av testsystemet i synnerhet för mindre skadliga exponeringsförhållandena. Den eldflugeluciferas hämmande föreningar DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 och DDD00023047 testades både in vitro genom att titta på effekterna på purified enzym och in vivo med användning av C. elegans luc: GFP-uttryckande stam. Det fanns inga bevis för att någon av de testade föreningarna orsakade nematod död under exponeringsförhållanden. Alla 4 föreningar påverkade luciferasaktiviteten in vitro vid de 2 koncentrationerna testade 25 och 100 pM (Figur 4A). DDD00001434 dödade aktiviteten hos det renade luciferas nästan helt, vilket gav en trovärdig motivering för den stora nedgången i in vivo mareld (Figur 4B). Även om in vitro och in vivo är inte direkt jämförbara, svaret på DDD00023047 var likartad i båda analyserna. DDD0001477 och DDD00000635 orsakade en större nedgång in vivo än in vitro. Dessa föreningar tillhandahölls till de levande maskar 22 timmar före luciferinsubstrat och resultaten kan återspegla att de inte lätt fördrevs från luciferas aktiva stället när luciferin blev tillgetiketten. Alternativt kan DDD0001477 och DDD00000635 har en extra effekt på cellulär ATP-nivåer. Detta måste bedömas med metoder som inte inbegriper eldflugeluciferas. Notera var den starka förbättringen av GFP signal med levande maskar som utsätts för förening DDD00000635. Detta kommer att diskuteras nedan. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> Figur 1. mitokondriella komplex I-inhibitor rotenon minskade energistatus C. elegans mätt genom bioluminiscens av stam PE254. Synchronized L4 scenen maskar (45-46 timmar efter mat ges till L1 larver) utsätts för 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 och 160 iM rotenon i 1% DMSO för 2 h (kort) eller 24 timmar (lång exponering) tidigare läsningar av bioluminiscens respektive vid 48 och 69 timmar av mask utveckling efter mat tillgänglig. Bioluminescens (enhets relativa ljusenheter, RLU) uttrycktes som en procentandel av fordonet (1% DMSO) värden. Felstaplar visar SEM av tekniska replikat vid varje rotenon koncentration (n = 6). Alla testade koncentrationer resulterade i en statistiskt signifikant skillnad i förhållande till vehikelkontroll (p &lt;0,001). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> Figur 2. oxidativa stressfaktorn parakvat minskade energistatus C. elegans stam PE254 på ett koncentrationsberoende sätt (mätt med bioluminiscens). Synkroniserad L4 scenen maskar (för enkelhets skull i detta fall på 41 timmar efter måltid tillhandahålls L1 larver) exponerades för 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 eller 8 mM parakvat för 24 timmar. GFP fluorescens (enhets Relativa fluorescensenheter, RFU) användes för att normalisera mareld data (enhet RLU), båda ändpunkterna som erhållits vid 65 h utveckling. Data uttrycks som procent av kontroller (1% DMSO). Felstaplar visar SEM av tekniska replikat(n = 5 för olika koncentrationer, n = 18 för kontroller). One-way ANOVA: *** p &lt;0,001 jämfört med vehikelkontroll. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> Figur 3. citronsyra cykeln mellan oxaloacetat (8 mM) förstärkt mareld C. elegans stam PE254. Synchronized L4 scenen maskar (45-46 timmar efter mat ges till L1 larver) exponerades för nygjord 8 mM oxalacetat under 18 timmar ± 30 minuter. Bioluminescens (enhet RLU) avlästes vid en utvecklingstillfället 63,5 tim ± 1 timme och uttrycktes som procent av vehikelkontrollen (DDH 2 O). Olika kolumner representerar olika datamängder av 8 tekniska replikat tilldelas olika plattor med 96 brunnar i samma experiment. Felstaplar visar SEM av tekniska replikat (n = 8). 2-vägs-ANOVA med &quot;set&quot; och &quot;koncentration&quot; som faktorer: ̵6; Set &quot;p&gt; 0,05,&quot; koncentration &quot;p &lt;0,001 och interaktionsterm p&gt; 0,05. EN <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> Figur 4. Provning av svaren till 4 föreningar från Dundee läkemedelsutveckling substansbibliotek 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 och C4: DDD00023047) med känd hämmande aktivitet på eldflugeluciferas luminiscens. (A) Effekt av föreningar på aktiviteten av renat luciferas från eldfluga (mätt som ljusenheter, RLU), uttryckt i procent av kontrollen över fordonet. ATP bioluminiscens CLSII kit (Roche, Mannheim, Tyskland) användes i enlighet med instruktioner med samma mängd av luciferasenzym alikvoterades till brunnar (vit 96-well mikrotiterplattor). ATP tillhandahålls vid en slutlig koncentration av 10 | iM och 1 | il av föreningen (slutlig koncentration anges) eller DMSO (1%) tillsattes. Luminiscens signal integrerades under 10 sekunder. Felstaplar visar SEM av tekniska replikat (n = 4). Analys: Enkelriktad ANOVA; * p &lt;0,05 eller *** p &lt;0,001 i förhållande till vehikelkontroll. Skillnader mellan 25 och 100 iM mycket betydelsefulla för C1 (DDD00001434, p &lt;0,001), och betydande för C2 och C3 (respektive DDD0001477 och DDD00000635; p &lt;0,05). (B) in vivo mätningar av mareld, bioluminiscens normaliserad till GFP fluorescens och GFP-fluorescens från C. elegans stam PE254 på 67 timmar utvecklings tid efter exponering för testföreningar för 22 timmar. Felstaplar visar SEM av tekniska replikat (n = 8). Statistisk analys (Ett sätt-ANOVA) utförs på poolade data från 3 datamängder (3 xn = 8). * p &lt;0,05 eller *** p &lt;0,001 i förhållande till respektive vehikelkontroll. Differences mellan 25 och 100 | iM endast statistiskt signifikant (p &lt;0,05) för normaliserad bioluminescens efter exponering till C4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tid på dagen </td><td> Dag 1 </td><td> Dag 2 </td><td> Dag 3 </td><td> Dag 4 </td><td> Dag 5 </td><td> Dag 6 </td><td> Dag 7 </td><td> Dag 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Steg 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Steg 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Steg 4 </td><td> Steg 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Steg 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><td&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> Steg 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> Steg 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> Steg 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Översikt över protokoll åtgärder som ska utföras på varje dag av nematod experiment (3 §) och föreslog tider.

Watch this Scientific Journal Video about A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

En sållningsbar<em&gt; In Vivo</em&gt; Analys för Mitochondrial Modulators Använda Transgena Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging för juvertumörer Använda IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generering av Transgena C. elegans Genom Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualisering av Caenorhabditis elegans Cuticle strukturer med hjälp av den lipofila Vital Dye, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En fluorescerande screeningsanalys för att identifiera modulatorer av GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraktion och analys i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...