Name: protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes
Uploaded: 2015-12-11T14:00:00
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The authors have nothing to disclose.

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las políticas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH) aprobadas por el Comité de Ética de Irán Universidad de Ciencias Médicas (Teherán, Irán). 1. Los animales, la cirugía y de muestras Preparaciones NOTA: Prepare el tejido cerebral para el análisis microscópico confocal 3D. <ol><li> Divida a los animales al azar en dos grupos: Aß 1-40: inyección (n = 8),...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

En el protocolo actual, hemos empleado morfometría confocal 3D para evaluar 12 parámetros diferentes que se asociaron con la morfología de astrocitos. Para este fin, el tejido del hipocampo de ratas con Aß 1-40 - se utilizaron astrogliosis inducida, con o sin pretratamiento genisteína como un agente anti-inflamatorio. Mediante el uso de imágenes en 3D y software morfométricos, hemos sido capaces de mostrar el efecto de la genisteína en astrogliosis es decir, la morfología de los astrocitos. ...

En el sistema nervioso central saludable (CNS), los astrocitos desempeñan un papel importante en la regulación del flujo sanguíneo, el metabolismo energético, la función sináptica y la plasticidad, y el ion extracelular y neurotransmisor homeostasis a 1-3. Además, los astrocitos responden a diferentes estímulos nocivos y condiciones anormales, tales como trauma, infección, isquemia o la neurodegeneración a través de astrogliosis reactiva que se caracteriza por la hipertrofia, proliferación y remodelación funcional de astrocitos 4,5. Astrogliosis reactiva puede diseñar la respuesta inflamatoria y proceso de reparación en el tejido y, por lo tanto, puede afectar a la evolución clínica de las intervenciones terapéuticas. En consecuencia, los astrocitos han recibido atención por parte de neurólogo durante las últimas décadas como objetivos potenciales para las intervenciones terapéuticas para una variedad de enfermedades que afectan el sistema nervioso central. Los astrocitos tienen normalmente una forma estrellada con el bienestar dramas efined que se extienden alrededor del soma 6. En una condición de enfermedad en el cerebro, se convierten en las ramas de astrocitos enrevesada hinchados y muestran extremos 7, por ejemplo en la presencia de beta amiloide (Aß). En este artículo se presenta un protocolo para el análisis de imágenes en 3D de astrocitos adquiridos por microscopía confocal. Se midieron doce parámetros cuantitativos diferentes para cada astrocito: las áreas superficiales y volúmenes de astrocito el territorio (el tejido cubierto por un astrocito), célula entera (incluyendo ramas), cuerpo de la célula, y el núcleo; la longitud total y el número de sucursales; la intensidad de fluorescencia de los anticuerpos utilizados para la detección de astrocitos; y la densidad de los astrocitos (número / 1000 m 2). Para este fin, hemos utilizado las secciones del cerebro de ratas expuestas a intrahipocampal inyección de Aß 1-40 con o sin tratamiento genisteína como una sustancia anti-inflamatorio. El protocolo descrito se puede utilizar para una morfométricoÁLISIS de diferentes tipos de células in vitro o in vivo en diferentes condiciones.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Como las células gliales en el cerebro, los astrocitos tienen diversos papeles funcionales en el sistema nervioso central. En presencia de estímulos nocivos, los astrocitos modifican sus propiedades funcionales y estructurales, una condición llamada astrogliosis reactiva. Aquí, se presenta un protocolo para la evaluación de las propiedades morfológicas de los astrocitos. Este protocolo incluye la cuantificación de 12 parámetros diferentes es decir, la superficie y el volumen del tejido cubierto por un astrocito (territorio de astrocitos), todo el astrocito incluyendo sucursales, cuerpo celular y núcleo, así como la longitud total y el número de sucursales, la intensidad de la fluorescencia inmunorreactividad de los anticuerpos utilizados para la detección de astrocitos, y la densidad de astrocitos (número / 1000 m 2). Para ello se crearon tres dimensiones (3D) imágenes microscópicas confocal, y la imagen 3D software de análisis, como se utilizó Volocity 6.3 para mediciones. Tejido cerebral de rata expuestos a beta amiloide 1-40 </se utilizó sub&gt; (Aß 1-40) con o sin una intervención terapéutica para presentar el método. Este protocolo también se puede utilizar para el análisis morfométrico 3D de otras células a partir de ya sea in vivo o in vitro condiciones.

Esta sección presenta algunos ejemplos de las observaciones cualitativas y cuantitativas producidos por análisis morfométrico 3D. Para los resultados completos de los 12 parámetros mencionados anteriormente, por favor, consulte nuestra publicación anterior 10. Observaciones cualitativas Los astrocitos mostraron ramas delgadas o gruesas que eran por lo general mucho tiempo en Aß 1-40 ratas inyectadas (Figura 1). Se obse...

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

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