Name: investigating functional regeneration in organotypic spinal cord co-cultures grown on multi-electrode arrays
Uploaded: 2015-09-23T14:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays at JoVE.com

This study was supported by the Swiss National Foundation (n&#176; 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)

<ol>
	<li>Avossa, D., Rosato&#8211;Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+circuits+formation:+a+study+of+developmentally+regulated+markers+in+organotypic+cultures+of+embryonic+mouse+spinal+cord.">Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord.</a> Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).</li><li>Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+developmental+profile+of+neurons+and+glia+in+motor+nuclei+of+the+brainstem+and+spinal+cord,+and+its+comparison+with+organotypic+slice+cultures.">Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures.</a> Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).</li><li>Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+characterization+of+rhythmic+activity+in+rat+spinal+cord+slice+cultures.">Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).</li><li>Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+oscillations+of+spiking+activity+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).</li><li>Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+correlated+spontaneous+activity+in+the+assembly+of+neural+circuits.">A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits.</a> Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).</li><li>Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rhythmic+patterns+of+activity+by+ventral+interneurones+in+rat+organotypic+spinal+slice+culture.">Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture.</a> J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).</li><li>Hanson, M. G., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+patterns+of+spontaneous+activity+are+required+for+correct+motor+axon+guidance+and+the+expression+of+specific+guidance+molecules).">Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules).</a> Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).</li><li>Courtine, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+supraspinal+control+of+stepping+via+indirect+propriospinal+relay+connections+after+spinal+cord+injury.">Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury.</a> Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).</li><li>Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+intraspinal+connections+in+a+new+in+vitro+model.">Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model.</a> Neuroscience. 262, 40-52 (2014).</li><li>Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+motor+neurons+corelease+glutamate+and+acetylcholine+at+central+synapses.">Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).</li><li>Tsuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+induces+selective+motor+neuron+death+in+organotypic+slice+cultures.">Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).</li><li>Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+activity+and+positive+feedback+in+motor+circuits+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).</li><li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture.">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).</li><li>Mentis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncholinergic+excitatory+actions+of+motoneurons+in+the+neonatal+mammalian+spinal+cord.">Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).</li><li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+are+rich+in+non&#8211;phosphorylated+neurofilaments:+Cross&#8211;+species+comparison+and+alterations+in+ALS.">Motor neurons are rich in non&#8211;phosphorylated neurofilaments: Cross&#8211; species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Res. 861 (45&#8211;58), (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

عدة عناصر في الإجراء قدم أساسية لإنجاز تجارب دقيقة وقابلة للتكرار. يتم تنفيذ جميع الخطوات أثناء إعداد الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف والحلول وإنتاج الثقافات شريحة تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي. لا يتم تطبيق المضادات الحيوية للوسط الغذائي لأنها يمكن أن تؤثر على النشاط العفوي 14. خلال طلاء MEA، والجزء الأهم هو التأكد من أن الخلية حل هلام مصفوفة يبقى باردا في جميع الأوقات. ذوبان الجليد في الثلاجة ويبقيه على الجليد لمدة الإجراء بأكمله لضمان درجة الحرارة القصوى قريبة من 0 درجة مئوية. أثناء إعداد شرائح العزل سريعة وباجتزاء، وكذلك الالتفات إلى درجة حرارة منخفضة باستخدام الثلج مخازن تشريح الباردة يزيد من نسبة ثقافات صحية. وعلاوة على ذلك، البلازما / ثرومبين التخثر هي واحدة من أهم الخطوات. أولا، تأكد من أن البلازما هي الورقة و صحيحد مع ثرومبين. الثانية، وإيلاء اهتمام خاص لإزالة أكبر قدر ممكن من بقايا ممكن لضمان التعلق الصحيح للشرائح على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. هذه الخطوة هي غاية الحساسة للوقت. إذا كانت الفترة الزمنية قصيرة جدا، وإزالة الكثير من الخليط البلازما / ثرومبين. إذا كان إطار زمني طويل جدا، تخثر حدث بالفعل، مما يزيد من مخاطر إزالة شرائح جنبا إلى جنب مع المتبقية البلازما / ثرومبين. إذا تم التخطيط الآفات الميكانيكية، فمن المهم استخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع تصميم دقيق. المنطقة حيث يهدف الآفة يجب أن تكون خالية من الأقطاب الكهربائية وأسلاك والعزل. خلاف ذلك، والكهربائية من شركة طيران الشرق الأوسط تسير للتلف وبالتالي، لا يمكن أن يؤديها التسجيلات بعد الآن. خطوة حاسمة أخرى تتعلق حجم الآفة. وقد تبين أنه سبق أن إعادة توصيل شريحتين الشباب بعد الآفة يستغرق حوالي يومين 10. لجميع التجارب، تم استخدام بحكم التجربة أن betwe الفضاءأون شرائح بعد الآفة لا ينبغي أن يكون أكبر من عرض الأخدود MEA (300 ميكرون). A حجم أكبر آفة قد يؤدي إلى فترة زمنية أطول لإعادة الاتصال أو، إذا كان آفة كبيرة جدا، لا إعادة الاتصال على الإطلاق. لتعليم، وكشفت التجارب السابقة أن وضع الأولي للشرائح اثنين أبعد من 1 مم النتائج في سرعة الاتصال منخفض جدا. قبل بداية التسجيلات، وقت التعديل لا يقل عن 10 دقيقة لRT، بدلا من 37 درجة مئوية في الحاضنة، وإلى حل خارج الخلية، بدلا من وسيلة التغذية الموصى بها. مراقبة وثيقة من نمط النشاط خلال هذه الدقائق الأولية يضمن أن البيانات المقاسة تمثل نمط انفجار الثقافة بشكل مناسب بعد أن بدأ تسجيل. للكشف عن النشاط، الحصول على البيانات ومزيد من المعالجة، والأجهزة المنزلية (غرفة تسجيل، وصلات إلى مكبرات الصوت ومكبرات الصوت)، وبرامج في مختبرVIEW، تستخدم C ++ وIgorPro. هي مناسبة الاجهزة MEA التجارية وحزم البرامج الأخرى فضلا عن هذه العمليات. هنا، وتتضخم الإشارات التي اطلعت عليها الأقطاب 1001 مرات، ثم رقمنة بمعدل 6 كيلو هرتز. يمكن للنموذج المقدم أن تكون أداة مفيدة لدراسة الاتصالات نخاعي مخصوص لفي الجسم الحي، فهي من الصعب دراسة دون تدخل تصاعدي وتنازلي مساحات الألياف. للزراعة المشترك للشريحتين الحبل الشوكي يمكن أن تلتف بأناقة هذه المسألة. ثقافات توفر المكروية التي يمكن السيطرة عليها بإحكام والتلاعب بها بسهولة. من ناحية أخرى، ومدخلات فوق الشوك والحسي هو بطبيعة الحال في عداد المفقودين. بالإضافة إلى ذلك، فإن عملية إعداد الثقافة تمثل حالة تلف الجهاز العصبي المركزي. ومن المعروف أن الخلايا الدبقية النجمية مثل والخلايا الدبقية الصغيرة للرد على الآفات مع زيادة انتشار وبالتالي، والنسيج هو إلى حد ما أعيد تنظيمها. تتصل وضع قدملم يكن لوحظ لتر تشكيل ندبة الدبقية بعد أداء الآفات الميكانيكية. يمكن أن يكون تفسير واحد أن آليات التكيف من الخلايا النجمية وقد أثار بالفعل أثناء عملية إعداد والآفات من الثقافات لم يسفر عن رد آخر. أيضا، لا يوجد أي دليل على تورط المايلين مثبطات المرتبطة بها، على سبيل المثال، Nogo-A، في إمكانية تجديد منخفضة من الثقافات lesioned في سن الشيخوخة. ومع ذلك، فقد تبين أن المعاملة مع مثبطات الفوسفو 4 Rolipram، بدءا مباشرة بعد أداء الآفات في 23 DIV التجديد زيادات الوظيفي بين شرائح 10. وتبين هذه النتائج أن الانتعاش وظيفية قابلة للزيادة في الثقافات القديمة. بشكل ملحوظ، عندما عد عدد من المحاور عبور موقع الآفة، تم اكتشاف أي اختلاف بين الثقافات lesioned في سن مبكرة والثقافات lesioned في سن الشيخوخة. وتشير هذه النتائج إلى أن عدم وجود تجدد المحاور ليست هي السبب و الكبرىأو فقدان الانتعاش بعد الآفات المتأخرة في الثقافة وبالتالي التأكيد على الحاجة إلى نموذج الذي يسمح التحليل الوظيفي للتجديد. تشكيل متشابك واللدونة متشابك يمكن أن تلعب دورا رئيسيا في عملية الانتعاش 10. اكتسبت هذه الآليات على الكثير من الاهتمام خلال السنوات الأخيرة، وهذه الأيام مقبولة على نطاق واسع أن لديهم تأثير كبير على نتائج بعد إصابة الحبل الشوكي. لذلك، يمكن للنموذج الذي يوفر ظروف مستقرة للتحقيق في هذه العمليات في عزلة وبقدر كبير من التفصيل يساعد بالتأكيد للحصول على فكرة عن تجديد وظيفية في الحبل الشوكي.

وقد استخدمت الثقافات شريحة عضوي النمط من الجهاز العصبي المركزي (CNS) على نطاق واسع لدراسة مختلف الظواهر الفسيولوجية والمرضية تمتد من تطوير الخلايا العصبية في التنكس العصبي. مقارنة مع ثقافات الخلية فصلها، وشرائح عضوي النمط توفر ميزة المزيد من التعقيد مع التهندس الخلوي سليمة والدوائر متشابك المحلية. وفي الوقت نفسه، يمكن تحليل الأنسجة بطريقة معزولة دون الحاجة إلى توريط تعقيد كله في سياق الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، هناك ما يبرر الوصول السهل والمتكررة لخلايا الاختيار، يمكن التحكم في البيئة خارج الخلية بدقة وعادة، في المختبر النماذج أقل تكلفة من نظرائهم في الجسم الحي. في السنوات الأخيرة، والدراسات المختلفة المعروضة أوجه الشبه بين ملامح التنموية الثقافات طويلة الأجل مقابل الحيوانات المقابلة يعيشون 1،2. وقد تبين أن الدوائر العصبية من مختلف CNS رجونانوثانية تعبر عن نشاط الشبكة عفوية خلال التنمية، وأن شرائح عضوي النمط حفاظ جزئيا هذه الظاهرة 3 -7. وقد استخدمت معزولة الاستعدادات الحبل الشوكي وخاصة للتحقيق في الجيل إيقاع 6 وتشكيل الدوائر العصبية 1. وهناك طريقة لتسجيل النشاط العفوي من شرائح عضوي النمط هو ثقافة لهم على رأس صفائف متعدد القطب الأطراف. هذه الأجهزة تحتوي على أقطاب متعددة والتي يمكن رصد إمكانات خارج الخلية الناتجة عن إمكانات العمل من العديد من الخلايا في وقت واحد (تسجيل متعددة الوحدات). القرار زمنية عالية من التسجيلات MEA يمكن استخدامها لإعادة بناء ديناميكية النشاط دقيقة داخل الدوائر العصبية معين. بالإضافة إلى ذلك، وعلى النقيض من التصحيح، تحامل على تقنية هو غير الغازية، والذي يسمح القياسات طويلة الأجل والنتائج في حقيقة أن الخلايا العصبية لا تتأثر في سلوكهم. Fأو الغرض من هذه الدراسة، تم استخدام مزيج من عضوي النمط الحبل الشوكي المشترك الثقافات والتسجيلات متعددة المواقع للتحقيق تجديد وظيفية داخل الحبل الشوكي. منذ الكبار الفقاريات العليا والقدرة على التعافي من الضرر من الحبل الشوكي محدودة، وقد درس استراتيجيات مختلفة لتشجيع تجديد بعد إصابة الحبل الشوكي. حتى الآن، وقد الجهاز القشري عادة في النظام النموذجي لاختيار لمثل هذه التحقيقات. هذه التجارب عادة ما تكون مضيعة للوقت ومكلفة وتتطلب الأفواج الحيوانات الكبيرة بسبب التباين الشديد ضمن مجموعات واحدة. وعلاوة على ذلك، تشير الدلائل إلى أن الاتصالات نخاعي مخصوص (الخلايا العصبية التي تقتصر تماما داخل الحبل الشوكي) يمكن أن تلعب دورا محوريا في عملية الانتعاش في أعقاب آفات الحبل الشوكي 8. هذه الألياف هي صعبة للدراسة في الجسم الحي دون تدخل تصاعدي وتنازلي مساحات الألياف. بونيسي وKapfhammer 9 يستخدم الحبل الشوكي الطوليالثقافات شريحة من الفئران بعد الولادة كنهج بديل. بعد أداء الآفات الميكانيكية حللوا شبه كمي لتجديد الصرفي من المحاور بين شرائح النخاع الشوكي. لاحظوا أقل ولكن ليس المحاور أيا عبور موقع الآفة في الثقافات قطع في سن ناضجة. في المقابل، الثقافات التي تم lesioned في مرحلة الشابة عرضها على كمية عالية من تجدد المحاور 5 - 7 أيام بعد الضرر. ومع ذلك، لم يعرض دليل للاتصالات وظيفية. ولذلك، فإن وضع ممثل في نموذج المختبر من الألياف نخاعي مخصوص التي تسمح التحقيق في تجديد وظيفية يمكن أن يكون أداة قيمة لتوسيع معرفتنا حول عمليات التجدد في النخاع الشوكي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Planar multielectrode array</td>
			<td>Qwane Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>custom-made according to the design of our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>80 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled, sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor-7S [5ng/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0513</td>
			<td>200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>reconstituted in wash solution with 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mg/L]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular solution (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mM]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent: Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3%, harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td align="right">5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2366</td>
			<td>Lyophilized, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gabazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SR-95531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mecamylamine hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2843</td>
			<td>toxic if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>harmful, 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-31</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-31P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-32</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-32R-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0532</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1123740001</td>
			<td>irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flat tube 10 (= roller tube)</td>
			<td>Techno Plastic Products AG</td>
			<td>91243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating functional regeneration in organotypic spinal cord co-cultures grown on multi-electrode arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

للتحقيق في احتمالات الانتعاش وظيفية للثقافات المشتركة المستمدة من الحبل الشوكي للأجنة الفئران E14، أجريت الآفات في إطار الوقت من 8-28 DIV. في وقت لاحق 2-3 أسابيع، تم تسجيل نشاط الخلايا العصبية عفوية مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (الشكل 1 C &amp; D). وقد تم التعرف على امكانات العمل المسجلة خارج الخلية حاليا لكل القطب الفردية (الشكل 1E). من هذه البيانات تم إنشاء المؤامرات النقطية (الشكل 1F)، تليها المؤامرات نشاط الشبكة لتصور النشاط الكلي بشكل منفصل لكل جانب (الشكل 1G). في كل شريحة عادة ما يتم تنظيم النشاط العفوي في رشقات نارية. إذا كنت متصلا شرائح وظيفيا، يمكن لهذه رشقات نارية نشر من شريحة واحدة إلى أخرى. لذلك، تم احتساب مبلغ رشقات نارية متزامنة بين شرائح اثنين لقياس كميا تجديد وظيفية. للحصول على وصف مفصل لكيفية الباحث التحولس المؤامرات مختلفة يتم تنفيذها وكيف تم اشتقاق صيغة لحساب النسبة المئوية للنشاط متزامنة، يرجى الاطلاع هايدمان وآخرون. 10. في كل التجارب، وكانت قد سجلت أول نشاط تحت الظروف القياسية. في الخطوة الثانية، تم حجب تثبيط متشابك بإضافة الإستركنين (1 ميكرومتر) وgabazine (10 ميكرومتر) إلى حل حمام خارج الخلية. هذا السلوك الفاضح يؤدي عادة إلى نمط النشاط أكثر انتظاما مع رشقات نارية طويلة وفترات تنفجر، مما يسهل تعريف رشقات نارية وبالتالي تحديد تزامن انفجار بين شرائح. ثقافات lesioned في سن مبكرة (7-9 DIV) المعروضة على كمية عالية من النشاط متزامنة بعد 2-3 أسابيع الآفة في حين أن الثقافات lesioned في مراحل لاحقة (&gt; 19 DIV) أظهرت انخفاض ملحوظ في القدرة على التجدد (الشكل 2 A - F). وتشير هذه النتائج إلى أن القدرة تجديدوصلات وظيفية في العمود الفقري الثقافات شريحة الحبل يقلل من مستوى عال، وتمثيل الدولة الجنينية في الجسم الحي، إلى مستوى منخفض، وتمثيل الدولة بمزيد من التطوير في الجسم الحي، في غضون ثلاثة أسابيع في الثقافة. ما هي أنواع الاتصالات تشارك فعليا في تزامن انفجار بين شرائح اثنين؟ إلى جانب وصلات نخاعي مخصوص، يمكن أن تنشأ ألياف أيضا من العصبونات الحركية أو الظهرية الخلايا العصبية العقدة الجذرية. وقد تبين أنه سبق أن الظهرية الخلايا العصبية العقدة الجذرية ليست ذات الصلة من أجل الربط الوظيفي بين الحبل الشوكي شرائح 10. ومع ذلك، ظلت مشاركة العصبونات الحركية الاحتمال. منذ معروفة العصبونات الحركية لتشكيل اتصالات كوليني إلى الخلايا العصبية في النخاع الشوكي من خلال مستقبلات النيكوتين 13، تم تسجيل نشاط النخاع الشوكي المشترك الثقافات في 8 DIV، وقت عرض الثقافات النشاط 10 متزامنة للغاية، وخصم النيكوتينيك Mecamوأضاف ylamine (MEC، و 100 ميكرومتر) إلى حل حمام خارج الخلية. ومن شأن مشاركة العصبونات الحركية في العلاقة بين شرائح اثنين يؤدي إلى انخفاض نسبة النشاط متزامنة. ومع ذلك، كان هذا ليس هو الحال (MEC: 91.0 ± 4.5٪، ن = 7؛ التحكم: 93.6 ± 4.6٪، ن = 7، ص&gt; 0.05، يلكوكسن مطابقة أزواج الاختبار). وتشير هذه النتائج إلى أن نقاط الاشتباك العصبي كوليني لا تساهم في الاتصال الوظيفي بين شرائح. ومع ذلك، منذ أن تبين أيضا العصبونات الحركية للافراج عن الغلوتامات في نقاط الاشتباك العصبي داخل الجهاز العصبي المركزي 11، 15، وهذه التجارب لا تستبعد تماما مشاركتها. لتحديد العصبونات الحركية stainings المناعى ضد غير فسفرته خيط عصبي H مع أجريت SMI-32. وكشفت عدة هيئات وصفت كبيرة خلية نموذجية لالعصبونات الحركية، موزعة على شرائح (الشكل 3A). وقد تم الإبلاغ عن SMI-32 الأجسام المضادة لتسمية الهيئات خلية من motoneuroنانوثانية 12 وهذا الاستنتاج ينطبق أيضا على الثقافات تستخدم 13. أيضا، stainings من أجسام الخلايا العصبية بشكل عام، على سبيل المثال، ضد ب-III-تويولين أو NeuN وكذلك أجسام الخلايا الدبقية، على سبيل المثال، الخلايا النجمية مع GFAP الضد تتماشى مع تقارير أخرى وتطابق الأوصاف المورفولوجية من هذين النوعين من الخلايا ( الرقم 3 B - D). ومع ذلك، فإن وضع العلامات من المحاور مع الأجسام المضادة SMI-32 والمتعلقة (الشكل 3E). مقابل التوقعات، تظهر شبكة ضخمة من الألياف عند استخدام هذه الأجسام المضادة، ويبدو مماثل لتلطيخ SMI-31 التي تصف مفسفر خيط عصبي H (الشكل 3F). تفسير واحد لهذه النتيجة يمكن أن تكون أن تنظيم التنموي للخيط عصبي الفسفرة / نزع الفسفات ليس كما مشددة في الثقافات المستخدمة مقارنة بالوضع في الجسم الحي. A حدوث مختلطة من neurofilaments مفسفر وغير فسفرته في نفس المحور العصبي يمكن أن EXPLعين هذه النتيجة. والاحتمال الآخر هو أن SMI-32 محاور المسمى تنشأ من الخلايا العصبية الإسقاط. وقد أظهرت تسانغ وزملاؤه 16 أن مثل ملطخة عمود وعمود الخلية المتوسط ​​الوحشي الخلايا العصبية كلارك التي كتبها SMI-32 إلى جانب العصبونات الحركية. يمكن ضوحا انتشار محوار من هذه الخلايا العصبية أيضا يفسر وفرة SMI-32 الألياف إيجابية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" /> الشكل 1. عرض وتحليل النشاط العفوي. (A) رسم تخطيطي لMEA. وصفت الأقطاب البلاتين مغطاة باللون الأسود، الأسلاك شفافة باللون الأحمر والأخدود في منتصف MEA باللون الأصفر. (B) عن قرب من مجموعة الكهربائي الموجود في وسط MEA. يتم تقديم المخططات تفضلت الدكتور M. Heuschkel. (C) صورة مشرق الميدان لالثقافيه القديمة 8 DIVه. نمت شرائح وتنصهر على طول الجانبين في مواجهة بعضهما البعض. ويمثل الشريط الأصفر الأخدود electrode- وخالية من العزل من MEA. على نطاق وبار = 400 ميكرون (D) الجدول الزمني للتجارب. يتم وضع شريحتين في النخاع الشوكي للأجنة الفئران E14 بجانب بعضها البعض على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. في غضون أيام قليلة، وشرائح تنمو والصمامات على طول الجانبين في مواجهة بعضهما البعض. في إطار زمني من 8-28 DIV، يتم تنفيذ الآفات كاملة من خلال الموقع الانصهار. في وقت لاحق أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من النشاط العفوي يتم تسجيلها ويتم إصلاح الثقافات لstainings المناعى. (E) آثار النشاط العفوي من كل قطب كهربائي الفردي للثقافة القديمة 23 DIV. لأوضح التصور، ويتضح فقط كل أثر الثاني. آثار البرتقال تصور النشاط الذي تم تسجيله من شريحة على الجانب الأيمن، وآثار الزرقاء من الجانب الأيسر. تتم مزامنة معظم رشقات نارية بين البلدين. يشير السهم إلى انفجار تحدث في شريحة اليسار أن ص فقطنشر artially إلى شريحة الصحيحة. النشاط في شريحة الصحيحة ولكن لم تصل إلى عتبة المختار لا يقل عن 25٪ من متوسط ​​النشاط ذروته القصوى من الجانب وفقا لذلك، لم يتم الكشف بمثابة انفجار. تكبير على اليمين تصور الماضي الزوج انفجار متزامن. (F) النقطية مؤامرة من النشاط هو مبين في (E). (G) قطعة نشاط الشبكة مع رشقات نارية محددة (القضبان دون خط الأساس) من النشاط هو مبين في (E). مقتبس من هايدمان وآخرون. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" /> الشكل 2. متزامنة مقابل آخر غير متزامنة. (A، B) المؤامرات النقطية الثقافات lesioneد في سن مبكرة (في 7-9 DIV)، والتي تبين النشاط متزامنة في ظل ظروف قياسية (A) وتحت السلوك الفاضح (B). (C، D) قطع النقطية الثقافات lesioned في سن القديم (في&gt; 19 DIV)، والتي تبين نشاط غير متزامنة تحت الظروف القياسية (C) وتحت السلوك الفاضح (D). (E، F) متوسط ​​نسبة النشاط تزامن خططت لكل يوم الآفة الفردية المسجلة تحت الظروف القياسية (E) وتحت السلوك الفاضح (F). اتخذت التسجيلات 2 - 3 أسابيع بعد يوم الآفة. مقتبس من هايدمان وآخرون. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" /> Figure 3. المناعى توصيف. (A) تلون أجسام الخلايا motoneuronal مع SMI-32. (B) β-III العلامات تويولين من أجسام الخلايا العصبية الناضجة وعملياتها. (C) تحديد الخلايا النجمية مع GFAP. (D) وسمها ناضجة خلايا الجسم العصبية مع NeuN. (E) SMI-32 تلطيخ من غير فسفرته خيط عصبي H. (F) خيط عصبي مفسفر H حددها SMI-31. مقتبس من هايدمان وآخرون. 10. لاحظ أنه مع كل من، SMI-31 و SMI-32، وهي شبكة كبيرة من الألياف غير مرئية في الثقافات. الحانات AD = 20 ميكرون، H &amp; F = 100 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays at JoVE.com

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

هنا نقدم البروتوكول الذي يقوم على شرائح النخاع الشوكي مثقف على صفائف متعدد القطب لدراسة تجديد الوظيفي للاتصالات نخاعي مخصوص في المختبر.

التحقيق التجديد الوظيفي في الحبل الشوكي عضوي النمط المشارك الثقافات نمت على صفائف متعدد القطب

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

تسجيلات صفيف متعدد القطب من الانهيارات الجليدية الخلايا العصبية في الثقافات عضوي النمط

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

وحدة للسيارات وظيفية في صحن الثقافة: شارك في ثقافة Explants النخاع الشوكي وخلايا العضلات

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Transection الحبل الشوكي في اليرقات الزرد

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

دوامة العقدة العصبية يزدرع الثقافة والكهربية على موضوع الكهربائي صفائف

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

عزل نويات الحبل الشوكي الكبار لتسلسل الحمض النووي الريبي المفرد-نواة موازية على نطاق واسع

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

التدريب القائم على النشاط في حلقة مفرغة مع النخاع الشوكي أصيب ويستار

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

التسليم داخل الشرايين للخلايا الجذعية العصبية إلى الدماغ الفئران والفأر: تطبيق على الإقفاري الدماغي

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...