Name: investigating functional regeneration in organotypic spinal cord co-cultures grown on multi-electrode arrays
Uploaded: 2015-09-23T14:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays at JoVE.com

This study was supported by the Swiss National Foundation (n&#176; 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)

<ol>
	<li>Avossa, D., Rosato&#8211;Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+circuits+formation:+a+study+of+developmentally+regulated+markers+in+organotypic+cultures+of+embryonic+mouse+spinal+cord.">Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord.</a> Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).</li><li>Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+developmental+profile+of+neurons+and+glia+in+motor+nuclei+of+the+brainstem+and+spinal+cord,+and+its+comparison+with+organotypic+slice+cultures.">Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures.</a> Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).</li><li>Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+characterization+of+rhythmic+activity+in+rat+spinal+cord+slice+cultures.">Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).</li><li>Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+oscillations+of+spiking+activity+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).</li><li>Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+correlated+spontaneous+activity+in+the+assembly+of+neural+circuits.">A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits.</a> Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).</li><li>Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rhythmic+patterns+of+activity+by+ventral+interneurones+in+rat+organotypic+spinal+slice+culture.">Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture.</a> J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).</li><li>Hanson, M. G., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+patterns+of+spontaneous+activity+are+required+for+correct+motor+axon+guidance+and+the+expression+of+specific+guidance+molecules).">Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules).</a> Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).</li><li>Courtine, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+supraspinal+control+of+stepping+via+indirect+propriospinal+relay+connections+after+spinal+cord+injury.">Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury.</a> Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).</li><li>Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+intraspinal+connections+in+a+new+in+vitro+model.">Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model.</a> Neuroscience. 262, 40-52 (2014).</li><li>Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+motor+neurons+corelease+glutamate+and+acetylcholine+at+central+synapses.">Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).</li><li>Tsuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+induces+selective+motor+neuron+death+in+organotypic+slice+cultures.">Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).</li><li>Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+activity+and+positive+feedback+in+motor+circuits+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).</li><li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture.">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).</li><li>Mentis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncholinergic+excitatory+actions+of+motoneurons+in+the+neonatal+mammalian+spinal+cord.">Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).</li><li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+are+rich+in+non&#8211;phosphorylated+neurofilaments:+Cross&#8211;+species+comparison+and+alterations+in+ALS.">Motor neurons are rich in non&#8211;phosphorylated neurofilaments: Cross&#8211; species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Res. 861 (45&#8211;58), (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Некоторые элементы в представленном порядке являются основополагающими для выполнения точных и воспроизводимых экспериментов. Все шаги во время подготовки МПС, решения и производства срез культуры осуществляется в стерильных условиях в ламинарном боксе. Антибиотики не применяются к питательной среде, потому что они могут влиять на спонтанную активность 14. Во время MEA покрытия, наиболее важной частью является, чтобы убедиться, что решение внеклеточный матрикс геля остается холодной на все времена. Оттепели в холодильник и держать его на льду в течение всей процедуры, чтобы обеспечить максимальную температуру, близкую к 0 ° С. В ходе подготовки ломтиков быстрого выделения и срезов, а также обращая внимания на низкой температуре с помощью льда холодные буферы рассечение увеличивает процент здоровых культур. Кроме того, плазма / тромбина коагуляции является одним из наиболее важных шагов. Во-первых, убедитесь, что плазма правильно михеd с тромбина. Во-вторых, обратить особое внимание на удаление столько остатка, как это возможно, чтобы обеспечить надлежащее крепление ломтиками в МПС. Этот шаг является чрезвычайно чувствительным ко времени; Если временной интервал слишком короток, слишком много плазмы / тромбина смеси удаляется. Если сроки слишком долго, коагуляция уже произошло, увеличивая риск удаления ломтики вместе с остаточной плазмы / тромбина. Если механические повреждения планируется, важно использовать МПС с точной конструкции. Область, где поражение предназначен должен быть свободным от электродов, проволоки и изоляции. В противном случае, электрика МЭС будут повреждены, и поэтому ни одной записи не может быть выполнена больше. Еще один важный шаг касается размера поражения. Было показано, что ранее повторном двух молодых ломтики после поражения занимает около двух дней 10. Для всех экспериментов, эмпирическое правило, что используют в космической betweан срезов после поражения не должны быть больше, чем ширина паза МЭС (300 мкм). Больший размер повреждения может привести к более длительный срок для повторного подключения или, если повреждение не является слишком большой, не переподключение вообще. Для аннотирования, бывшие эксперименты показали, что начальная установка из двух ломтиков дальше, чем 1 мм в результаты очень низкой скорости соединения. Перед началом записей, временем регулировки, по меньшей мере 10 мин до комнатной температуры, вместо 37 ° C инкубатора и с внеклеточным раствором, вместо питательной среде рекомендуется. Тщательное наблюдение картины деятельности в течение этих начальных минут гарантирует, что измеренные данные представляют разрывной образец культуры надлежащим после записи был начат. Для обнаружения активности, сбора данных и дальнейшей обработки, домашнее метизы (запись камеры, подключение к усилителям и усилителей), программы в ЛабораторииВЗГЛЯД, С ++ и IgorPro используются. Коммерческие MEA настройки и другие программные пакеты подходят также для этих операций. Здесь, сигналы видно электродами, усиливаются 1001 раз, а затем оцифрованы со скоростью 6 кГц. Представленная модель может быть полезным инструментом для изучения проприоцептивных соединения, так как в естественных условиях, они трудны для изучения без вмешательства восходящих и нисходящих волокон трактаты. Совместное культивирование двух спинного мозга ломтиками может элегантно обойти этот вопрос. Культуры обеспечить микросреду, которые могут быть жестко контролируемой и легко манипулировать. С другой стороны, надостный и сенсорный вход, конечно, отсутствует. Кроме того, процесс подготовки культура представляет ситуацию поражения ЦНС. Глиальные клетки, такие как астроциты и микроглии, как известно, отвечают на поражений с повышенной пролиферацией и, следовательно, ткань в определенной степени реорганизованной. Относительно представленного режимел образование глиальных шрам после выполнения механические повреждения не наблюдалось. Одним из объяснений может быть, что адаптивные механизмы астроцитов уже срабатывает в процессе подготовки и поражений культур не приведет к дальнейшему ответ. Кроме того, нет никаких доказательств причастности миелиновых ингибиторов, связанных, например,., Nogo-A, в низкой регенеративного потенциала культур повреждениями в старости. Тем не менее, было показано, что лечение с фосфодиэстеразы 4 ингибитора Ролипрам, начиная непосредственно после выполнения поражений на 23 DIV увеличивает функциональную регенерации между кусочками 10. Эти результаты показывают, что функциональное восстановление может быть увеличена в старых культур. Заметно, при подсчете количества аксонов, пересекающих поражения сайт, не было обнаружено никакой разницы между культурами повреждениями в молодом возрасте и культур повреждениями в старости. Эти данные свидетельствуют о том, что отсутствие регенерации аксонов не главная причина еили потеря восстановления после поражений в конце культуры и, следовательно, подчеркнуть необходимость для модели, что позволяет функциональный анализ регенерации. Формирование синапсов и синаптической пластичности могли бы играть важную роль в процессе восстановления 10. Эти механизмы получили много внимания в последние годы, и это в настоящее время широко признается, что они имеют большое влияние на исход после повреждения спинного мозга. Таким образом, модель, которая обеспечивает стабильные условия для расследования этих процессов в изоляции и в мельчайших подробностях, безусловно, может помочь получить представление о функциональной регенерации спинного мозга.

Органотипической срез культуры центральной нервной системы (ЦНС) широко используются для изучения различных физиологических и патологических явлений идущие от нейронов развития с нейродегенерацией. По сравнению с культурами клеток диссоциированных, органотипической ломтики имеют преимущество большей сложностью с интактной цитоархитектуры и местного синаптической схемы. В то же время, ткань может быть проанализирована в изолированной форме без необходимости вовлечь Сложность в целом в естественных условиях. Кроме того, легко и повторил доступ к клеткам выбора является оправданным, внеклеточный среда может быть точно контролировать и, как правило, модели, в пробирке являются менее дорогостоящими, чем их коллеги в естественных условиях. В последние годы, различные исследования представлены поразительные сходства между профилями развития долгосрочных культур по сравнению с аналогичным живых животных 1,2. Было показано, что нейрональные цепей различного ЦНС регио-нс выразить спонтанную сетевую активность в ходе развития и органотипической ломтики частично сохранить этот феномен 3 -7. Изолированные препаратах спинного мозга были особенно используется для исследования генерации ритма 6 и формирование нейронных цепей 1. Способ записи спонтанной активности органотипических срезов культуры их сверху мульти-электродных массивов (МПС). Эти устройства содержат несколько электродов, которые могут контролировать внеклеточные потенциалы, генерируемые потенциалов действия из многочисленных клеток одновременно (многоквартирных записи). Высокая временное разрешение МПС записей может быть использован для восстановления динамики точные деятельности в пределах данной нейронной цепи. Кроме того, в отличие от патча зажима технику является неинвазивным, которая позволяет долгосрочные результаты измерений и в том, что нейроны не влияет на их поведение. Fили цель данного исследования, сочетание органотипических спинного мозга сокультурах и многоузловых записей был использован для исследования функционального регенерацию в спинном мозге. Так взрослых высших позвоночных были ограниченный потенциал, чтобы оправиться от повреждения спинного мозга, различные стратегии были изучены, чтобы способствовать регенерации после повреждения спинного мозга. Пока Кортикоспинальных тракта, как правило, был моделью система выбора для таких исследований. Эти эксперименты, как правило, отнимает много времени, дорогим и требует больших когорт животных из-за высокой изменчивости в пределах одной группы. Кроме того, данные свидетельствуют о том, что проприоцептивных соединения (нейроны, которые полностью заключенных внутри спинного мозга) могут играть ключевую роль в процессе восстановления после повреждений спинного мозга 8. Эти волокна трудно учиться в естественных условиях без вмешательства восходящих и нисходящих волокон трактаты. Bonnici и Kapfhammer 9 используется продольный спинной мозгломтик культуры послеродовых мышей в качестве альтернативного подхода. После выполнения механические повреждения они проанализировали полуколичественно морфологическое восстановление аксонов между сегментов спинного мозга. Они наблюдали, но не менее ни один аксоны, пересекающих сайт поражения в культурах, вырезанных в зрелом возрасте. В отличие от этого, культур, которые были повреждениями в молодом этапе отображается большое количество регенерации аксонов 5 - 7 дней после повреждения. Тем не менее, доказательство функциональных связей не была представлена. Таким образом, развитие представителя в модели пробирке проприоцептивных волокон, позволяет исследовать функциональное регенерации может быть ценным инструментом для расширить наши знания о регенеративных процессов в спинном мозге.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Planar multielectrode array</td>
			<td>Qwane Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>custom-made according to the design of our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>80 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled, sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor-7S [5ng/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0513</td>
			<td>200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>reconstituted in wash solution with 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mg/L]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular solution (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mM]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent: Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3%, harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td align="right">5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2366</td>
			<td>Lyophilized, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gabazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SR-95531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mecamylamine hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2843</td>
			<td>toxic if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>harmful, 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-31</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-31P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-32</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-32R-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0532</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1123740001</td>
			<td>irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flat tube 10 (= roller tube)</td>
			<td>Techno Plastic Products AG</td>
			<td>91243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating functional regeneration in organotypic spinal cord co-cultures grown on multi-electrode arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Чтобы исследовать потенциал для восстановления функций совместного культивировани, полученных из спинного мозга крысиных эмбрионов E14, поражения проводили во временном окне от 8 до 28 DIV. От 2 до 3 недель, спонтанная активность нейронов регистрировали с МПС (Рисунок 1 C &amp; D). В внеклеточно, записанные потенциалы действия были определены форума для каждой отдельной электрода (рис 1E). Из этих данных растровые участки были сгенерированы (рис 1F), затем сетевой активности участков для визуализации общую активность отдельно с каждой стороны (рис 1G). В каждой секции спонтанную активность, как правило, организованы в всплесков. Если кусочки функционально связаны, эти всплески могут распространяться от одного среза на другую. Таким образом, количество синхронизированных вспышек между двумя ломтиками была рассчитана для количественного измерения функциональной регенерации. Для детального описания того, как Int преобразованияО различных участков осуществляется и как была получена формула для расчета процент синхронизированной активности, пожалуйста, см Heidemann др. 10. Во всех экспериментах, активность впервые был отмечен в стандартных условиях. На втором этапе, синаптической ингибирование заблокирован добавлением стрихнин (1 мкМ) и gabazine (10 мкМ) в растворе ванны внеклеточной. Это расторможенность обычно приводит к более регулярной деятельности узор с длительными очередями и лопаются интервалами, что облегчает определение очередей и, таким образом, определение синхронизации сигнала между ломтиками. Культуры повреждениями в молодом возрасте (7 - 9 дел) отображается большое количество синхронизированной активности через 2-3 недели после поражения в то время как культуры поражений на более поздних стадиях (&gt; 19 дел) показали явное снижение способности к регенерации (рисунок 2 А - F). Эти данные показывают, что способность к регенерациифункциональных связей в спинного мозга срезов культур уменьшается от высокого уровня, представляющий состояние эмбриональных в живом организме, на низком уровне, представляющий дальнейшее развитие состояния в живом организме, в течение трех недель в культуре. Какие соединений на самом деле участвует в пачке импульсов синхронизации между двумя ломтиками? Кроме того, проприоцептивных соединений, волокна могут также возникать из мотонейронов или спинных ганглиев. Было показано, что ранее спинные нейроны ганглиев корень не имеют отношения к функциональной связности между спинной мозг ломтики 10. Тем не менее, участие мотонейронов остается возможность. Так мотонейроны, как известно, образуют холинергические подключения к нейронов спинного мозга через никотиновые рецепторы 13, активность спинного мозга сокультурах был записан в 8 DIV, то время, когда культуры обнаруживают сильно синхронизированной активности 10, и никотиновой антагониста Mecamиламин (MEC, 100 мкМ) добавляли к раствору ванны внеклеточной. Участием мотонейронов в связи между двумя ломтиками приведет к снижению процента синхронизированной активности. Тем не менее, это был не тот случай (MEC: 91,0 ± 4,5%, п = 7; управление: 93,6 ± 4,6%, п = 7, р&gt; 0,05, критерий Вилкоксона соответствует тест пар). Эти результаты показывают, что холинергические синапсы не вносят вклад в функциональной связи между кусочками. Однако, поскольку мотонейроны, также было показано, чтобы освободить глутамат в синапсах в ЦНС 11, 15, эти эксперименты не совсем исключить их участие. Чтобы определить мотонейронов иммуногистохимических окрашивания против нефосфорилированном нейрофиламентов H с SMI-32 были выполнены. Они показали несколько меченых большие клеточные тела двигательных нейронов, характерные для, распределенных по ломтики (рис 3а). Прерываний SMI-32 антитела, как сообщается, маркировать клеточных тел motoneuroнс 12 и эта находка имеет также верно для используемых культур 13. Кроме того, окрашивание нейронных клеточных тел в целом, например, против б-III-тубулина или NeuN, а также глиальных клеточных тел., Например, астроциты с GFAP антитела в соответствии с другими отчетами и соответствовать морфологические описания этих типов клеток ( Рисунок 3 В - D). Тем не менее, маркировка аксонов с SMI-32 антитела в отношении (рис 3E). Вопреки ожиданиям, это огромная сеть из волокон появляется при использовании этого антитела и он похож на окрашивание SMI-31, что маркирует фосфорилированную нейрофиламентов H (рис 3F). Одно из толкований этого результата может быть, что регулирование развития нейрофиламентов фосфорилирования / дефосфорилирования не так плотно в используемых культур по сравнению с в естественных условиях ситуации. Смешанный появление фосфорилированных и нефосфорилированный нейрофиламентов в то же аксона может EXPLайн этот вывод. Другая возможность состоит в том, что ГИУ-32 меченых аксонов возникают из проекционных нейронов. Цанг и его коллеги 16 показали, что, например,, столбцов и столбцов intermediolateral клеток нейроны Кларка окрашивают по SMI-32, кроме моторных нейронов. Произносится аксонов распространение таких нейронов может также объяснить обилие SMI-32 положительных волокон. <img alt="фигура 1" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" /> Рисунок 1. Отображение и анализ спонтанной активности. (А) Схема с МЭА. Электроды платины покрыты изображены в черных, прозрачных проводов в красный и канавки в середине МЭС желтый. (Б) Крупный план электродной решетки, расположенной в центре МЭС. Диаграммы любезно предоставлены доктором М. Heuschkel. (С) Светлый поля изображения 8 DIV старой КУЛЬТУРАе. Срезы выросли и слиты вместе сторонах, обращенных друг к другу. Желтый бар представляет собой electrode- и изоляции без канавки МЭС. Масштаб бар = 400 мкм (D) Хронология экспериментов. Два спинного мозга ломтики эмбрионов крыс E14 находятся рядом друг с другом на МПС. В течение нескольких дней, ломтики расти и предохранитель по сторонах, обращенных друг к другу. В сроки от 8 - 28 DIV, полные повреждения производится путем слияния сайта. Два-три недели спустя спонтанная активность регистрируется и культуры закреплены за иммуногистохимических окрашивания. (Е) Спонтанные следов активности каждого отдельного электрода 23 DIV старой культуры. Для более четкого визуализации, только каждый второй след показано на рисунке. Оранжевые следы изобразить активность, которая была записана с ломтиком на правой стороне, синие следы от левой стороны. Большинство вспышек синхронизированы между ними. Стрелка указывает на взрыв, происходящие в левом срезе, что только рartially распространяются на правой секции. Деятельность в правильном копии, однако не достигли выбранного порога, по крайней мере 25% от усредненной максимальной пиковой активности по стороне, и поэтому не обнаруживается в порыве. Увеличения на право изображать последней синхронизации разрыва пары. (F), растровый сюжет активности, показанной в (Е). (G), Сетевая активность участок, определяемые всплесков (баров ниже базового уровня) в активности, показанной в (Е). Взято из Heidemann др. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" /> Рисунок 2. Синхронное против не синхронизированной активности. (А, Б) Растровые участки культур lesioneд в молодом возрасте (в 7 - 9 дел), показывая синхронизированной активности в стандартных условиях (А) и при расторможенность (B). (С, D) Растровые участки культур повреждениями в старости (при&gt; 19 дел), показывая не синхронизированной активности в стандартных условиях (C) и под расторможенность (D). (E, F) Средний процент синхронизированной активности построены для каждого отдельного дня поражения записанного в стандартных условиях (Е) и под расторможенность (F). Записи были сделаны 2 - 3 недели после дня поражения. Взято из Heidemann др. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" /> Figure 3. Иммуногистохимический характеристика. (А) Окрашивание мотонейронов клеточных тел с SMI-32. (Б) β-тубулина III маркировки зрелых нейрональных клеток органов и их процессов. (С) Идентификация астроцитов GFAP с. (D), маркировка зрелого нейронов клетки тела с NeuN. (Е) SMI-32 окрашивание нефосфорилированный нейрофиламентов H. (F) Фосфорилированный нейрофиламентов H определены SMI-31. Взято из Heidemann др. 10. Следует отметить, что с обоими, SMI-31 и SMI-32, большая сеть волокон видна в культурах. Бары AD = 20 мкм, H &amp; F = 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays at JoVE.com

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Здесь мы приводим протокол, основанный на срезах спинного мозга культивировали на нескольких матриц электродов для изучения функциональной регенерации проприоцептивных соединений в пробирке.

Исследуя функциональное Регенерация в Органотипической спинного мозга сопредседателей культур, выращенных на нескольких электродов массивов

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-электрод массив записей из нейронов Лавины в органотипической культур

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Функциональный блок двигателя в культуре блюдо: Co-культуре эксплантов спинного мозга и мышечных клеток

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Перерезки спинного шнур в личиночной данио рерио

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Лазерно-индуцированное Травма спинного мозга модель для оценки Механизмы дегенерации аксонов в режиме реального времени

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Спирального ганглия Нейрон эксплант и электрофизиологии на многопроцессорных электродных Массивы

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging нейронной активности в первичной соматосенсорной коры, с помощью Thy1-GCaMP6s трансгенных мышей

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Изоляция взрослых спинной ядра для массивно параллельной сингл ядро РНК последовательности

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Деятельности на основе обучения на беговой дорожке с спинного мозга травмы крыс Вистара

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Внутриархивная доставка нейронных стволовых клеток крыс и мышей мозга: Применение к церебральной ишемии

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...