Name: early viral entry assays for the identification and evaluation of antiviral compounds
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds at JoVE.com

This study is supported by funding from Taipei Medical University Hospital (102TMU-TMUH-19) and the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Observera: Se till att alla förfaranden som rör cellkultur och virusinfektion sker i certifierade biosäkerhet kåpor som är lämpliga för biosäkerhetsnivån av proverna som hanteras. I syfte att beskriva protokollen är Gaussia luciferas reporter-märkta HCV som modell virus 32. I samband med de representativa resultat, är föreningarna chebulagic syra (Chla) och punicalagin (MOPS) används som kandidat antivirala medel som riktar virala glykoprotein interaktioner med cellytan glykosaminoglykaner under den tidiga viralt inträde steg 31. Heparin, som är känt för att interferera med införandet av många virus 30,31,33,34, används som en positiv kontrollbehandling i ett sådant sammanhang. För grundläggande bakgrund på virologi tekniker, förökning av virus, bestämning av virustiter, och expression av infektiös dos i plackbildande enheter (PFU), fokusera bildande enheter (FFU), eller multiplicitet av infektion (MOI), är läsaren reförts till referens 35. För tidigare exempel och optimerade betingelser som användes för virus som visas i representativa resultat, hänvisas till referenser 30-32,36-39 samt uppgifter som anges i tabell 1, figur 1A och figur 2A. 1. Cell Culture, förening beredning, och förening cytotoxicitet <ol><li> Odla den respektive cellinje för virusinfektionen systemet som skall analyseras (tabell 1). För HCV, odla Huh-7,5-celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 200 U / ml penicillin G, 200 ^ g / ml streptomycin och 0,5 | ig / ml amfotericin B. </li><li> Preparera testföreningar och kontroller med hjälp av deras respektive lösningsmedel: exempelvis upplösa Chla och Mops i dimetylsulfoxid (DMSO); förbereda heparin i sterilt dubbeldestillerat vatten. För alla efterföljande utspädningar, använda odlingsmedia. Obs: Den slutliga concentranson av DMSO i testföreningsbehandlingar är mindre än 1% i experimenten; 1% DMSO är inkluderad som en negativ kontrollbehandling vid analyserna för jämförelse. </li><li> Bestäm cytotoxiciteten av testföreningarna (t ex, Chla och PUG) på cellerna under den virala infektionen genom användning av en cellviabilitet bestämning reagens såsom XTT (2,3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl] -5-fenylamino) karbonyl] -2H-tetrazolium-hydroxid): <ol><li> För HCV, utsäde Huh-7,5-celler i en 96-brunnars platta (1 x 10 4 celler per brunn) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N för erhållande av ett monoskikt. </li><li> Applicera DMSO kontroll (1%) eller ökande koncentrationer av testföreningarna Chla och MOPS (ex. 0, 10, 50, 100 och 500 M) till kulturbrunnarna i tre exemplar. </li><li> Inkubera vid 37 ° C under 72 h, sedan kassera mediet i plattan och tvätta cellerna med 200 pl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger. </li><li> Tillsätt 100 ni assaying lösning från XTT-baserad in vitro-toxikologi analyssats till varje brunn och inkubera plattorna vid 37 ° C under ytterligare 3 h för att tillåta XTT formazanproduktion. </li><li> Bestäm absorbansen med en mikroplattläsare vid en testvåglängd av 492 nm och en referensvåglängd av 690 nm. </li><li> Beräkna andelen överlevande celler med hjälp av följande formel: cellviabiliteten (%) = At ​​/ Som x 100%, där &quot;I&quot; och &quot;Som&quot; avser absorbansen av testföreningarna och lösningsmedelskontroll (ex 1% DMSO. ) behandlingar, respektive. Bestäm koncentrationen av 50% cellulär cytotoxicitet (CC 50) för testföreningar från en analytisk programvara såsom GraphPad Prism enligt tillverkarens protokoll. </li></ol></li></ol> 2. Avläsning av virusinfektion Obs! Avläsning av virusinfektion beror på virus system som används och kan innebära metoder såsom plackanalyser eller measuring reportersignaler från reporter-taggade virus. Metoden för att påvisa reporter-HCV-infektion baserat på luciferas reporteraktivitet beskrivs nedan. <ol><li> Samla supernatanterna från de infekterade brunnarna och klargöra vid 17.000 xg i en mikrocentrifug under 5 minuter vid 4 ° C. </li><li> Blanda 20 pl testsupernatant till 50 | il luciferas-substrat från Gaussia luciferasanalysen kit och direkt mäta med en luminometer enligt tillverkarens instruktioner. </li><li> Uttryck HCV infektivitet som log 10 av relativa ljusenheter (RLU) för bestämning virala hämning (%) och beräkna den effektiva koncentrationen 50% (EG 50) av testföreningarna mot HCV-infektion med användning av algoritmer från GraphPad Prism mjukvara enligt tillverkarens protokoll. </li></ol> 3. Virusinaktive Assay Obs: Exempel på inkubationstiden och viral dos för olika virus enre anges i figur 1A. Högre koncentrationer av viruset kan också testas genom att öka MOI / PFU. <ol><li> Seed Huh-7,5-celler i en 96-brunnars platta (1 x 10 4 celler per brunn) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N för erhållande av ett monoskikt. </li><li> Inkubera testföreningarna eller kontroller (slutkoncentrationer är: Chla = 50 iM; MOPS = 50 iM; heparin = 1,000 mikrogram / ​​ml, DMSO = 1%) med HCV-partiklar vid 37 ° C (Figur 1A, &quot;Long-Term&quot; ) i en 1: 1-förhållande. Till exempel, för en 100 ul virus inokulum innehållande 1 x 10 4 FFU, tillsätt 100 pl av en 100 iM Chla arbets utspädning; detta ger Chla behandling vid en slutlig koncentration av 50 pM. </li><li> Späd viruset-läkemedelsblandningen till &quot;subterapeutisk&quot; (ineffektiva) koncentration av testföreningarna. Till exempel är den ineffektiva koncentrationen av Chla och MOPS mot HCV vid en iM 31; därfördetta kräver en 50-faldig spädning av viruset-läkemedelsblandningen vilket kan åstadkommas med 9,8 ml basalmedium (cellodlingsmedium med 2% FBS). Obs: Utspädnings till sub-terapeutisk koncentration förhindrar signifikant interaktion mellan testföreningarna och värdcellytan och tillåter undersökning av behandlingseffekten på de cellfria virioner. Observera att denna utspädning är beroende av den antivirala dosresponsen av testföreningarna mot särskilt virusinfektion, och bestäms innan du utför denna analys 31. </li><li> Som jämförelse, blanda virus med testföreningarna och omedelbart utspädd (ingen inkubationstid) till sub-terapeutisk koncentration före infektion (Figur 1A, &quot;Short-Term&quot;). </li><li> Tillsätt 100 | il av den utspädda HCV-läkemedelsblandningen på Huh-7,5-cellmonoskikt (mängden virus ligger nu på en x 10 2 FFU; slutlig MOI = 0,01) och inkubera under 3 h vid 37 ° C för att tillåta viraltadsorption. </li><li> Efter infektionen, ta bort den utspädda inokulat och försiktigt tvätta brunnarna med 200 pl PBS två gånger. Obs: Utför tvättar försiktigt för att undvika att lyfta cellerna. </li><li> Tillsätt 100 ul av basalmedium till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 72 timmar. </li><li> Analysera den resulterande infektion genom analys av supernatanten för luciferasaktivitet som beskrivs i &quot;2. Avläsning av virusinfektion &quot;. </li></ol> 4. Viral Attachment Analys Obs: Exempel på inkubationstiden och viral dos för olika virus listas i figur 2A, &quot;beslag&quot;. Högre koncentrationer av viruset kan också testas genom att öka MOI / PFU. <ol><li> Seed Huh-7,5-celler i en 96-brunnars platta (1 x 10 4 celler per brunn) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N för erhållande av ett monoskikt. </li><li> Pre-chill cellmonoskikt i plattor vid 4 ° C for 1 h. </li><li> Co-behandla cellerna med HCV-inokulat (MOI = 0,01) och testföreningar eller kontroller (slutkoncentrationer är: Chla = 50 uM; MOPS = 50 uM; heparin = 1000 | j, g / ml; DMSO = 1%) vid 4 ° C under 3 tim. Till exempel, för en 90 pl virus inokulum innehållande 1 x 10 2 FFU, tillsätt 10 ul av en 500 iM Chla arbets utspädning; detta ger Chla behandling vid en slutlig koncentration av 50 pM och en infektion av HCV vid MOI = 0,01 på cellmonoskiktet. Obs: Det är viktigt att utföra experiment vid 4 ° C, eftersom det gör det möjligt för virusbindning, men utesluter posten som mest effektivt sker vid 37 ° C. Utför tillsatsen av virus och testföreningar på is och den efterföljande inkubation i en 4 ° C kylskåp för att säkerställa att temperaturen hålles vid 4 ° C. </li><li> Avlägsna supernatanten och tvätta försiktigt cellmonoskiktet med 200 pl iskall PBS två gånger. Obs: Utför tvättar försiktigt för att undvika att lyfta cellerna &lt;./ li&gt; <li> Tillsätt 100 ul av basalmedium till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 72 timmar. </li><li> Analysera den resulterande infektion genom analys av supernatanten för luciferasaktivitet som beskrivs i &quot;2. Avläsning av virusinfektion &quot;. </li></ol> 5. Viral Entry / Fusion-analys Obs: Exempel på inkubationstider och viral dos för olika virus listas i figur 2A &#39;Entry / Fusion &quot;. Högre koncentrationer av viruset kan också testas genom att öka MOI / PFU. <ol><li> Seed Huh-7,5-celler i en 96-brunnars platta (1 x 10 4 celler per brunn) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N för erhållande av ett monoskikt. </li><li> Pre-chill cellmonoskikt i plattor vid 4 ° C under 1 timme. </li><li> Infektera celler med HCV (MOI = 0,01) vid 4 ° C under 3 h. Till exempel använder en 100 ul virus inokulum innehållande 1 x 10 2 FFU. Obs: Utför ytterlining av det virala inokulum på is och den efterföljande inkubation i en 4 ° C kylskåp för att hålla temperaturen vid 4 ° C, vilket tillåter viral bindning men inte posten. </li><li> Avlägsna supernatanten och försiktigt tvätta cellmonolagren med 200 pl iskall PBS två gånger. Obs: Utför tvättar försiktigt för att undvika att lyfta cellerna. </li><li> Behandla brunnarna med testföreningarna eller kontroller (slutkoncentrationer är: Chla = 50 uM; MOPS = 50 uM; heparin = 1000 | j, g / ml; DMSO = 1%) och inkubera vid 37 ° C under 3 h. Till exempel, tillsätt 10 ul av en 500 iM Chla arbetsspädning till 90 pl av media, blanda, och behandla brunnarna; detta ger Chla behandling vid en slutlig koncentration av 50 pM. Obs: Den förskjutning från 4 ° C till 37 ° C underlättar nu den viralt inträde / fusion händelse och därför tillåter bedömning av testföreningar &#39;effekt på detta speciella steg. </li><li> Aspirera läkemedelsinnehållande supernatanten och avlägsna icke-internaextracellulära virus genom antingen tvättning med 200 pl citratbuffert (50 mM natriumcitrat, 4 mM kaliumklorid, pH 3,0) eller PBS. Tillsätt 100 ul av basalmediet före inkubering vid 37 ° C under 72 timmar. </li><li> Analysera den resulterande infektion genom analys av supernatanten för luciferasaktivitet som beskrivs i &quot;2. Avläsning av virusinfektion &quot;. </li></ol>

<ol>
	<li>Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+vaccines:+progress+to+date.">HIV vaccines: progress to date.</a> Drugs. 71, 387-414 (2011).</li><li>Rothman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+dengue+virus:+a+tale+of+original+antigenic+sin+and+tropical+cytokine+storms.">Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms.</a> Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).</li><li>Sung, H., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+current+status+of+cytomegalovirus+vaccines.">Update on the current status of cytomegalovirus vaccines.</a> Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).</li><li>Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+development+of+preventive+and+therapeutic+vaccines+for+hepatitis+C+virus.">Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).</li><li>Wright, M., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+prevention+and+therapy:+past,+present,+and+future.">Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future.</a> Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).</li><li>Christou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+bacterial+and+viral+zoonotic+infections.">The global burden of bacterial and viral zoonotic infections.</a> Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).</li><li>Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+socio-ecology+of+zoonotic+infections.">The socio-ecology of zoonotic infections.</a> Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).</li><li>Grais, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measles+vaccination+in+humanitarian+emergencies:+a+review+of+recent+practice.">Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice.</a> Confl Health. 5, 21 (2011).</li><li>Gautret, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+viral+respiratory+tract+infections-environmental+risk+factors+and+transmission.">Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission.</a> Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).</li><li>Sampathkumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+East+respiratory+syndrome:+what+clinicians+need+to+know.">Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know.</a> Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).</li><li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus:+a+Clear+and+Present+Danger.">Ebola Virus: a Clear and Present Danger.</a> J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).</li><li>Bishop, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+Emerging+Treatment+Options+for+Ebola+Virus+Disease.">Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease.</a> Ann Pharmacother. , (2014).</li><li>Arduino, P. G., Porter, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+and+perioral+herpes+simplex+virus+type+1+(HSV-1)+infection:+review+of+its+management.">Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management.</a> Oral Dis. 12, 254-270 (2006).</li><li>Mitrasinovic, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+structure-based+design+of+the+influenza+A+neuraminidase+inhibitors.">Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors.</a> Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).</li><li>Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+acting+antivirals+against+hepatitis+C+virus.">Directly acting antivirals against hepatitis C virus.</a> J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).</li><li>Haqqani, A. A., Tilton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+inhibitors+and+their+use+in+the+treatment+of+HIV-1+infection.">Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection.</a> Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).</li><li>Melby, T., Westby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+viral+entry.">Inhibitors of viral entry.</a> Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).</li><li>Vanderlinden, E., Naesens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+antiviral+strategies+to+interfere+with+influenza+virus+entry.">Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry.</a> Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).</li><li>Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+targeted+therapeutics:+a+new+era+of+anti-herpes+simplex+virus-1+therapeutics.">Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics.</a> Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).</li><li>Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hepatitis+C+virus+life+cycle+as+a+target+for+new+antiviral+therapies.">The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies.</a> Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).</li><li>Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New-generation+screening+assays+for+the+detection+of+anti-influenza+compounds+targeting+viral+and+host+functions.">New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions.</a> Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).</li><li>Kilianski, A., Baker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+antiviral+screening+against+coronaviruses:+developing+virus-specific+and+broad-spectrum+inhibitors.">Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors.</a> Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).</li><li>Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerases+of+hepatitis+C+viruses+and+flaviviruses:+structural+and+mechanistic+insights+and+drug+development.">Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development.</a> Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).</li><li>Frey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+cell-cell+fusion+induced+by+the+envelope+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 69, 1462-1472 (1995).</li><li>Tscherne, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-+and+temperature-dependent+activation+of+hepatitis+C+virus+for+low-pH-triggered+entry.">Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry.</a> J Virol. 80, 1734-1741 (2006).</li><li>Madan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+umbrellas:+a+novel+class+of+candidate+topical+microbicides+to+prevent+human+immunodeficiency+virus+and+herpes+simplex+virus+infections.">Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections.</a> J Virol. 81, 7636-7646 (2007).</li><li>Haywood, A. M., Boyer, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+and+temperature+dependence+of+influenza+virus+membrane+fusion+at+neutral+pH.">Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH.</a> J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).</li><li>Haywood, A. M., Boyer, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+membrane+fusion:+time+course+and+effect+of+temperature,+pH,+calcium,+and+receptor+concentration).">Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration).</a> Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).</li><li>Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+cells+by+Sindbis+virus+at+low+temperature.">Infection of cells by Sindbis virus at low temperature.</a> Virology. 362, 461-467 (2007).</li><li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolyzable+tannins+(chebulagic+acid+and+punicalagin)+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread.">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> J Virol. 85, 4386-4398 (2011).</li><li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry.">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiol. 13, 187 (2013).</li><li>Marukian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture-produced+hepatitis+C+virus+does+not+infect+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells.</a> Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).</li><li>Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfated+polysaccharides+are+potent+and+selective+inhibitors+of+various+enveloped+viruses,+including+herpes+simplex+virus,+cytomegalovirus,+vesicular+stomatitis+virus,+and+human+immunodeficiency+virus.">Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus.</a> Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).</li><li>Barth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+binding+of+hepatitis+C+virus+envelope+glycoprotein+E2+requires+cell+surface+heparan+sulfate.">Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate.</a> J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Virology. , (2008).</li><li>Brown, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+caspase-dependent+apoptosis+in+antibody-enhanced+dengue+virus+infection+of+human+mast+cells.">Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells.</a> J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).</li><li>Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+host+responses+to+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+following+intranasal+administration+of+a+Protollin-adjuvanted,+epitope-enhanced+recombinant+G+protein+vaccine.">Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine.</a> J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).</li><li>Isaacson, M. K., Compton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+glycoprotein+B+is+required+for+virus+entry+and+cell-to-cell+spread+but+not+for+virion+attachment,+assembly,+or+egress.">Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress.</a> J Virol. 83, 3891-3903 (2009).</li><li>Leonard, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measles+virus+blind+to+its+epithelial+cell+receptor+remains+virulent+in+rhesus+monkeys+but+cannot+cross+the+airway+epithelium+and+is+not+shed.">Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed.</a> J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).</li><li>Ciesek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+tea+polyphenol,+epigallocatechin-3-gallate,+inhibits+hepatitis+C+virus+entry.">The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry.</a> Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).</li><li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saikosaponin+b2+is+a+naturally+occurring+terpenoid+that+efficiently+inhibits+hepatitis+C+virus+entry.">Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry.</a> J Hepatol. 62, 541-548 (2015).</li><li>Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+methods+for+influenza+antiviral+drug+discovery.">Screening methods for influenza antiviral drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).</li><li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+virus+inhibitors+by+influenza+A+virus+specific+reporter+cell+based+screening.">Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening.</a> Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).</li></ol>

The authors declare that no competing interests exist.

In this report the methods to identify and evaluate antiviral compounds based on a mechanistic approach of dissecting the early viral entry events were described. Specifically, the assays allowed us to examine the effect of test compounds on free virus particles, viral attachment, and viral entry/fusion. Critical steps were implemented to distinctly evaluate the drug effect on the specific stage of early viral entry. For instance, in the &#8216;viral inactivation assay&#8217;, the dilution of the virus-drug mixture to sub-therapeutic concentration prevents significant interaction between the test compound and the host cell surface by &#8216;titrating out&#8217; the drug. This ensures that the inhibitory effect observed on the subsequent infection of the host cell is due to a direct interaction between the test compound and the cell-free virions, rather than an effect from the test compound on host cell membrane or membrane-associated molecules, including viral receptors30. Similarly, the shift in temperature between 4 &#176;C (which allows for virus binding but not entry) and 37 &#176;C (which facilitates virus entry/fusion) in the &#8216;viral attachment assay&#8217; and &#8216;viral entry/fusion assay&#8217; are crucial to determine the test compound&#8217;s effect on each of these specific events. This is feasible due to the temperature sensitivity of enveloped viruses during these steps in the infection24-29. It is therefore important that the assays are performed at the indicated temperature to ensure the accuracy of the results; for example, by carrying out the experiment on ice to maintain at 4 &#176;C and by placing the sample directly in a 37 &#176;C incubator for the temperature shift. In addition, the use of negative (ex. DMSO solvent for drug preparation) and positive (ex. heparin treatment) controls also help further establish the assays&#8217; accuracy. The utility and applicability of such methods have been demonstrated in many antiviral studies26,30,31,40,41. Note that while heparin is included as a control for all three assays in the context of the representative results, it typically blocks the initial virus binding rather than the ensuing fusion/entry step (as reflected by the data in Figure 2). Additional controls could also be used, such as neutralizing antibodies directed against the virus (for viral inactivation assay), antibodies that mask the cell surface receptors for the virus (for viral attachment assay), and membrane fusion inhibitors (for viral fusion/entry assay). 
The assays described in this report, which are specific to the early stages of the viral infection, are useful in terms of application as secondary tests to characterize the mechanism of action of candidate drugs from primary screens which typically target the viral infection more broadly. Alternatively, they could also be incorporated in primary screens if one is specifically looking for inhibitors of early viral entry, including virus inactivating agents, viral attachment antagonists, and inhibitors to viral entry/fusion. In this case, their use allows a more focused and precise screen analysis for the identification of mechanism-specific antiviral candidates, which, in turn, would expedite downstream drug development. 
The use of cell-based assays in identifying antiviral agents provides several important advantages compared to biochemical assays, including revealing potential off-target effects (such as cytotoxicity) and adding physiological relevance to the bioactivity of the test agents42. These issues are important considerations for deciding whether a candidate agent is of value for continuation in subsequent phases of drug development. Similarly, the early viral entry-specific assays described in this report allow examination of the drug effect on the distinct viral entry stage at the cellular level, and more specifically in the context of an authentic viral infection in vitro. The results obtained from such assays would therefore help better predict the antiviral efficacy of the test compounds and also identify potentially unwanted off-target effects against the host cell. One potential limitation though, is that an in vitro cell-based assay may not completely reflect the actual in vivo entry step in the context of a natural viral infection. Nonetheless, the assays presented in this protocol do serve as an analytical platform for mechanism-based identification and evaluation of novel antiviral agents.
The development of reporter viruses or reporter cell systems to quantitate the amount of viral infection has greatly facilitated cell-based screening and evaluation of antiviral compounds. Examples include the use of recombinant viruses carrying a reporter gene or by means of recombinant human cell lines containing a reporter gene driven by the specific virus promoter31,43. In this report, the infection from luciferase-tagged HCV can be easily monitored by quantitating the reporter signal, thus facilitating data analysis. By incorporating these useful reporter-based tools, the early viral entry assays described here can essentially be adapted into high-throughput format for mechanism-based screening of small molecule libraries.
In conclusion, a protocol was described for assays dissecting the early viral entry as a means of identifying and evaluating mechanism-specific antiviral compounds. Such assays would be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to viral entry and help expand the scope of antiviral agents for development as prophylactic and/or therapeutic treatments.

Viral infections are a constant threat to the public health and a significant cause of epidemic diseases, morbidity, and deaths worldwide. Specific modes of control against viral infections include vaccine development and antiviral therapies. While vaccine efforts have proven successful in immunizing against several viruses, many viral pathogens remain without a protective vaccine including dengue virus (DENV), human cytomegalovirus (HCMV), hepatitis C virus (HCV), human immunodeficiency virus (HIV), and respiratory syncytial virus (RSV)1-5. Antivirals, on the other hand, play an important role for the management of these viral infections when prophylactic vaccines are unavailable. However, to date, only few licensed and cost-effective antiviral drugs are available compared to the number of viral pathogens that threatens the public health. More importantly, due to an increase in global travel and rapid urbanization, the situation is aggravated by risks of epidemic outbreaks from emerging/re-emerging viral infections that are being introduced into non-indigenous areas6. Recent outbreaks caused by severe acute respiratory syndrome (SARS) virus, influenza viruses (H1N1, H5N1, H3N2, and H7N9), DENV, West Nile virus (WNV), measles virus (MV), Middle East Respiratory Syndrome (MERS) virus, and Ebola virus6-12 are among the examples reflecting the need for antivirals development when immunization and/or therapeutics are unavailable. In addition, there is always a potential risk of generating drug-resistant infections with currently used antivirals. Thus, the continuous development and expansion of the scope of antivirals to these emerging/re-emerging viral infections are necessary to provide better management strategies and safeguard the public health.
Most antiviral therapies consist of direct acting antivirals (DAAs) which target a specific viral protein or cofactor that mediates important steps in the viral life cycle. For example, the nucleoside analogue Acyclovir inhibits herpesvirus DNA polymerase, protease inhibitors Boceprevir and Telaprevir antagonize the HCV NS3, and Oseltamivir and Zanamivir are neuraminidase inhibitors that block the release of influenza virus particles from infected cells13-15. There are however very few licensed viral entry inhibitors including Enfuvirtide, which targets HIV gp41 to prevent fusion, and Maraviroc, which blocks the HIV co-receptor CCR5, thereby preventing viral entry16. Exploring novel antagonists/inhibitors to viral entry could help provide additional therapeutics for prophylactic or therapeutic use, such as in combination with other antivirals with a different mechanism of action to better manage viral infections17-19. 
Identification of antivirals can involve structure-guided drug design and candidate drug screening-based strategy. Methods for assessing antiviral activity of test agents include biochemical assays of enzymatic activity and evaluation by cell-based systems20-23. In cell-based systems, the viral life cycle can be dissected into distinct stages of infection, such as entry events (attachment, fusion, uncoating), the replication phase (viral genome replication and protein translation), and virion egress (assembly, maturation, and release). Since the assays can be adapted to investigate each specific stage using various tools and methods, this approach allows identification/examination of potential candidate antivirals with a specific mechanism of action targeting the distinct stage analyzed. For instance, to analyze drug effect specifically on the free virus particles prior to binding to the host cell, a &#8216;viral inactivation assay&#8217; can be performed. In this assay, the virus is allowed to incubate with the test drug and then diluted to titrate out the drug before infecting a cell monolayer. Additional steps such as viral attachment and entry/fusion stages can also be analyzed individually, by shifting the temperature during the infection. For many enveloped viruses, viral entry/fusion at the host cell membrane is greatly facilitated at 37 &#176;C, but is typically precluded at 4 &#176;C which does not affect virus binding24-29. Finally, the use of reporter viruses or cell systems could facilitate these studies and permit a high-throughput analysis.
We previously employed the cell-based approach and dissected the early entry of various enveloped viruses for the examination of antiviral compounds that potentially antagonize viral entry30,31. Herein, the various methods used, including viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion assays, are described.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11995-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro toxicology assay kit, XTT-based</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TOX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instrument, Inc.</td>
			<td>ELx800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLux Gaussia luciferase assay kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E3300L&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GloMax-20/20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate, dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

early viral entry assays for the identification and evaluation of antiviral compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

I figur 1, var &quot;virusinaktive analys&quot; för att undersöka om två specifika naturliga föreningar Chla och MOPS kan inaktivera de olika höljeförsedda virus i cellfritt tillstånd och förhindra efterföljande infektion. Cytotoxiciteten och antivirala dos-respons av dessa föreningar har bestämts innan du utför den mekanistiska studier 31. Virusen som förbehandlats med testföreningarna och därefter virusläkemedelsblandningar späddes till sub-terapeutiska koncentrationer före inokulering på respektive cellmonoskiktet för varje virus-system. Såsom visas i fig 1, både Chla och MOPS verkade interagera med de cellfria virioner, vilket resulterar i irreversibla effekter som skyddade cellmonoskiktet från efterföljande infektion. De två testföreningarna uppnått en nära 100% inhibition mot HCMV, HCV och DENV-2, medan en 60-80% blockad sågs mot MV och RSV. Dessa resultat Suggest som Chla och MOPS har direkt inverkan på dessa fria viruspartiklar genom att inaktivera dem och neutralisera deras smittsamhet. I figur 2, var den bifogade filen och posten / fusion analyser genomförs för att undersöka effekten av Chla och MOPS mot dessa tidiga virala inträde relaterade händelser från HCMV, HCV, DENV-2, MV, och RSV. Både Chla och MOPS förhindras effektivt bindning av de undersökta virus på respektive värdcellen som visas genom hämning på den resulterande virusinfektion (Figur 2, &quot;beslag&quot;: ljust grå staplar). Den hämmande effekten på virus fastsättning av båda föreningarna var likartad mot HCMV (figur 2B), HCV (figur 2C), DENV-2 (figur 2D), och RSV (Figur 2F), som sträcker sig från 90 till 100%. Å andra sidan, föreföll MOPS att vara mer effektiva än Chla mot MV-bindning (fig 2E), med inhibitionshastighet från two föreningar varierar mellan 50-80%. Kontrollbehandlingen heparin, som är känd för att blockera inträde av många virus, också inhiberade vidhäftning av HCMV, DENV-2, RSV, ad MV, men var mindre effektiv mot HCV. Den påföljande &quot;viralt inträde / fusion-analysen&quot; undersökte huruvida Chla och MOPS bibehöll sin aktivitet under virus posten / fusion fasen (Figur 2, &#39;Entry / Fusion &quot;: mörk grå staplar). Återigen var båda Chla och MOPS observer att effektivt försämrar viralt inträde / fusion steget av de virus som undersökts (figur 2B - F), vilket ger en 50 - 90% skyddande effekt på den respektive cellmonoskiktet. Heparin också potent inhiberade inträde / fusion i DENV-2 och RSV-infektioner, men var mindre effektiv mot HCMV, HCV och MV (&lt;40% hämning i genomsnitt). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Virus </td><td> Celltyp </td></tr><tr><td> HCMV </td> &lt;td&gt; HEL </td></tr><tr><td> HCV </td><td> Huh-7,5 </td></tr><tr><td> DENV-2 </td><td> Vero </td></tr><tr><td> MV </td><td> CHO-SLAM </td></tr><tr><td> RSV </td><td> HEp-2 </td></tr></tbody></table> Tabell 1:. Värd celltyp för virusinfektion Celltypen som används för varje virusinfektion system som beskrivs i de representativa resultat indikeras. Ytterligare detaljer beträffande cellerna kan hittas i 31 referens. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig1.jpg" /> Figur 1. Inaktivering av virusinfektioner vid testföreningarna Chla och MOPS Olika virus behandlades med testföreningarna under en lång period. (Inkuberas under 1,5 - 3 h före titreringen, ljusgrå staplar) eller kort period (omedelbart späddes; mörkgrå staplar) vid 37 ° C före en utspädning till subterapeutisk Concentraning och efterföljande analys av infektion på respektive värdceller. (A) Schema för experimentet (visas till vänster) med den slutliga viruskoncentrationen (PFU / brunn eller MOI), långtidsvirusdrog inkubationsperioden (i), och efterföljande inkubationstid (ii) anges för varje virus i tabellen till höger. Analys för (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, och (F) RSV indikeras i varje ytterligare panelen. Resultaten plottas mot DMSO negativ kontroll behandling för virusinfektion och de data som visas är medelvärden ± standardfel av medelvärdet (SEM) från tre oberoende experiment. Denna siffra har ändrats från 31 referens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig2.jpg" /> Figur 2. Utvärdering av antivirala verksamhet testföreningarna Chla och MOPS mot virus kvarstad och inträde / fusion. (A) Den experimentella proceduren, virus koncentration (PFU / brunn eller MOI), och tiden för tillsats och behandling med testföreningarna (I, II, III) presenteras för varje virus i schemat och tillhörande tabeller. I virusfästanalys (ljusgrå staplar), monoskikt av olika celltyper för-kyld vid 4 ° C under 1 timme, därefter sam-behandlades med respektive virus och testföreningar vid 4 ° C (1,5 - 3 h, i) innan tvätta bort inokulat och testföreningarna för efterföljande inkubation (37 ° C, ii) och undersökning av virusinfektion. I virus inträde / fusion analys (mörkgrå staplar), ympade cellmonoskikt var för-kyld vid 4 ° C under 1 h och därefter utmanades med respektive virus vid 4 ° C under 1,5 - 3 h (i). Celler sedantvättades och behandlades med testföreningarna för en ytterligare inkuberingsperiod (ii) under vilken temperaturen skiftades till 37 ° C för att underlätta viralt inträde / fusion händelse. Vid slutet av inkuberingen extracellulära virus avlägsnades genom antingen citratbuffert (pH 3,0) eller PBS-tvättar och cellerna inkuberades ytterligare (iii) för analys av virusinfektion. Resultat för (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, och (F) RSV indikeras i varje ytterligare panelen. Data plottas mot DMSO negativ kontroll behandling av virusinfektion och presenteras som medelvärden ± SEM från tre oberoende experiment. Denna siffra har ändrats från 31 referens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds at JoVE.com

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Tidig viralt inträde Analyser för identifiering och utvärdering av antivirala föreningarna

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Kvantitativa analyser av alla influensa typ A Viral Hemagglutinins och neuroaminidaser använda Universal antikroppar i enkla mätmetoder Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Förstärka och kvantifiera HIV-1 RNA i hiv-infekterade individer med virusnivåer under gränsen för upptäckt med vanliga kliniska analyser

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Analyser för identifiering av nya Virushämmande medel mot blåtungevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Koncentration Fastställande Genom plackanalyser: med hjälp av traditionella och Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Hög-throughput kvantitativ realtids-RT-PCR-analys för bestämning av uttryck Profiler av typ I och III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitativa och kvantitativa analyser för att upptäcka och karakterisering av protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvecklingen av lyofiliserad Loop-medie Isothermal amplifieringsreagenserna för detektion av<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Pinnurvalsmetoden för påvisande av humana Norovirus på ytor

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Rening av virus-DNA för identifiering av associerade Viral och cellulära proteiner

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Utvärdering av Zika Virus-specifika T-cell svar i Immunoprivileged organ av infekterade Ifnar1- / - möss

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...