Name: bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.

The authors have declared that they have no competing financial interests.

Den nuværende protokol er med succes blevet brugt til at generere fuld længde infektiøse cDNA kloner for to forskellige stammer (CNU / LP2 27 og SA 14 -14-2 28) JEV, et flavivirus hvis funktionelle cDNA har vist sig at være meget vanskeligt at konstruere og udbrede grund af værtscelle toksicitet og den genetiske ustabilitet af det klonede cDNA 8,74-76 Denne protokol omfatter tre hovedkomponenter:. første, maksimere syntesen / amplifikation af en tro cDNA-kopi af virus-RNA ved anvendelse af high-fidelity reverse transcriptase / DNA-polymerase; andet kloning af virale prM-E-kodende region indeholder toksiske sekvenser (upublicerede data) 74,77,78 i en meget lav kopiantal vektor BAC fra den oprindelige cDNA subkloning til det endelige cDNA monteringstrin i fuld længde; og for det tredje anvendelse af en kloningsvektor BAC, der kan rumme et fremmed DNA med en gennemsnitlig størrelse på 120-350 kb, 19-21 som tilsyneladende tåler større DNA Inserts end andre kloningsvektorer. Denne kloning tilgang vil være generelt gældende for mange andre positive-streng RNA-virus, især dem med en stor RNA genom ~ 10 til 32 kb. Dannelse af en infektiøs cDNA-klon er et vigtigt skridt i udviklingen af ​​et omvendt genetik for RNA-vira, især for positive-strengede RNA-virusser, fordi dens genom virker som viral mRNA, som translateres til proteiner ved værtscellelinier ribosomer. Således kan viral replikation initieres ved indføring af et cDNA-afledt genomlængde RNA-molekyle i en modtagelig værtscelle. Tilgængeligheden af et infektiøst cDNA-klon JEV, når de kombineres med rekombinant DNA-teknologi, har øget vores forståelse af forskellige aspekter af den virale livscyklus på det molekylære niveau, såsom genekspression 73,79 og genomreplikation. 63,64 Også en fuld længde JEV-cDNA-klon har vist sig at være et værdifuldt redskab til udvikling af antivirale vacciner 28 og gen-levering vektorer. &lt;sup&gt; 80,81 Som med alle positive-strengede RNA-virusser, der er flere kritiske trin i at konstruere en pålidelig funktionel cDNA for JEV hvorfra stærkt smitsomme RNA&#39;er kan syntetiseres in vitro. Ideelt set bør sekvensen af ​​de syntetiske RNA&#39;er transskriberet fra en klon af fuld-længde cDNA være identisk med det virale genomiske RNA, især de 5&#39;- og 3&#39;-terminale sekvenser, der er nødvendige til initiering af viral RNA-replikation . 60-62 I den nuværende protokol, det autentiske 5&#39;- og 3&#39;-ender blev sikret ved at placere SP6 promotorsekvensen opstrøms for den første adeninnukleotid af det virale genom og anbringelse af en unik kunstig XbaI restriktionssite nedstrøms for den sidste thyminnukleotid af det virale genom, henholdsvis. Udjævnede syntetiske RNA&#39;er med autentiske 5&#39;- og 3&#39;-ender blev fremstillet ved afstrømning transkription af et Xba I-lineariseret og MBN-behandlede cDNA template hjælp SP6 RNA-polymerase primet med m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) En hætte analog. Denne protokol kan modificeres på flere måder. For in vitro-transkription, kan en anden bakteriofag RNA-polymerase (fx T3 eller T7) anvendes i forbindelse med sin veldefineret promotorsekvens. 27 Som afstrømning site, kan et andet restriktionssted anvendes, hvis det ikke er til stede i det virale genom, og hvis syntetisk RNA fra det lineariserede cDNA ender med autentiske 3&#39;-enden. Betydningen af 3&#39;-enden nukleotidsekvensen er blevet påvist ved en ~ 10-fold fald i RNA-infektivitet, når et syntetisk RNA indeholder tre eller fire virus-relateret nukleotider i sin 3&#39;-ende. 27 i en in vitro transkriptionsreaktion, både m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A og m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G cap analog kan anvendes lige godt, selv om de sidstnævnte steder en uafhængig ekstra G-nukleotid opstrøms for viral 5 &#39;-end, menDesuden ændrer ikke infektivitet eller replikation af syntetisk RNA. 27 Endvidere fjernelse af cDNA-skabelon fra RNA-transkripter af DNase I fordøjelsen er ikke nødvendig for RNA infektivitet tests, fordi cDNA selve skabelonen ikke er infektiøse. 27 BAC-teknologi er nu blevet anvendt på konstruere infektiøse cDNA kloner for en håndfuld positiv-strengede RNA-vira, nemlig to JEVs, CNU / LP2 27 og SA 14 -14-2 28 (genom størrelse, ~ 11 kb); to denguevirusser, BR / 90 26 og NGC 29 (~ 11 kb); bovin virus diarré-virus, SD1 (~ 12 kb), 25 to klassisk svinepest virus, C og Paderborn (~ 12 kb), 24 grænsen disease virus, Gifhorn (~ 12 kb), 24 den porcint reproduktions- og respiratorisk syndrom virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb), 30 den overførbar gastroenteritis virus, PUR46-MAD (~ 29 kb), 16 af felin infektiøs peritonitis virus,DF-2 (~ 29 kb), 32 den alvorlige akut respiratorisk syndrom coronavirus, Urbani (~ 30 kb) 9 Mellemøsten respiratorisk syndrom coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), 17 og den menneskelige coronavirus, OC43 (~ 31 kb) 31 Den største fordel ved at anvende BAC&#39;er til cDNA konstruktion er den høje genetiske stabilitet af de store, 1- eller 2-kopi BAC plasmider.; imidlertid er den iboende natur sin ekstremt lavt kopiantal også en stor ulempe, på grund af meget lave udbytter af BAC DNA og den deraf følgende reduktion i renheden af ​​BAC DNA med hensyn til værtens kromosomale DNA. I den nuværende protokol, er udbyttet af BAC-DNA maksimeret ved at dyrke E. coli DH10B transformeret med det infektiøse BAC pBAC / SA 14 -14-2 i en næringsrig medium, 2 x YT. På trods af denne indsats, det gennemsnitlige udbytte er kun ~ 15 ug BAC DNA fra 500 ml 2 x YT-medium. Desuden er renheden af ​​BAC DNA bedst opnås ved anvendelse af CsCl-EtBr densitetsgradientcentrifugering til oprensningSnarere end den almindeligt anvendte kolonne-baserede plasmid isolation. Det er imidlertid vigtigt at huske på, at BAC-transformerede E. coli bør ikke overgrow fordi det kan true den genetiske stabilitet af det klonede cDNA, og højere vækst ikke nødvendigvis føre til større udbytter eller højere renhed BAC DNA. Den her beskrevne protokollen er et optimeret, effektiv og strømlinet metode til konstruktion og udbredelse af en genetisk stabil fuld længde infektiøse cDNA klon som BAC for JEV, en procedure, engang troede praktisk taget umuligt. Det samme kloningsstrategi kan også anvendes til mange andre positive-strengede RNA-vira. Generelt infektiøse cDNA-kloner gør det muligt at indføre en række mutationer (f.eks deletioner, insertioner og punktmutationer) i et viralt RNA-genom at studere deres biologiske funktioner i virusreplikation og patogenese. Denne cDNA-baseret revers genetik system gør det muligt at udvikle og TESt-vaccine og terapeutiske kandidater rettet mod en virulensfaktor (e) af en bestemt positiv-streng RNA-virus af interesse. Desuden kan denne smitsomme cDNA-teknologi også anvendes som en viral vektor, der kan udtrykke et fremmed gen (er) af interesse for mange anvendelser inden for biomedicinsk forskning.

For RNA virologer, fremkomsten af rekombinant DNA-teknologi i slutningen af 1970&#39;erne gjorde det muligt at omdanne virale RNA genomer til cDNA-kloner, som derefter kunne opformeres som plasmider i bakterier til genmanipulation af RNA-vira. 1 Den første RNA-virus for at være molekylært klonet var bakteriofag Qp, en positiv-strenget RNA-virus, der inficerer Escherichia coli. Et plasmid indeholdende en komplet cDNA-kopi af Qp genomisk RNA gav anledning til infektiøse fager Qp når den indføres i E. coli. 2 Kort tid efter blev denne teknik anvendes på poliovirus, en positiv-strenget RNA-virus hos mennesker og dyr. Et plasmid, der bærer et fuldlængde-cDNA af poliovirus genomisk RNA blev infektiøse, når de transficeres i pattedyrceller og i stand til at producere infektiøse virioner 3 I dette &quot;DNA-lanceret&quot; måde, skal de klonede cDNA&#39;er transkriberes intracellulært at indlede viral RNA-replikation.;Det er imidlertid uklart, hvordan transkription initieres, og hvordan de transkripter behandlet til den korrekte virale sekvens. Denne bekymring har ført til udviklingen af en alternativ &quot;RNA-lanceret&quot; tilgang, hvor en komplet cDNA-kopi af det virale RNA-genom, klones under en promotor genkendt af en E. coli eller fag-RNA-polymerase til fremstilling af syntetiske RNA&#39;er in vitro med defineret 5&#39;- og 3&#39;-termini, der undergår den fuldstændige virale replikationscyklus når det indføres i værtsceller. 4,5 Den første succes med denne fremgangsmåde blev rapporteret for brome mosaic virus 6,7 en positiv-strenget RNA-virus af planter. Siden da har den RNA-lanceret tilgang er udviklet til en lang række positive-RNA-vira, herunder calicivirus, alphavira, flavivirus, arterivirusser og coronavirusser. 1,4,5,8 I både DNA- og RNA-lanceret omvendt genetik systemer, opførelse af en full-længde cDNA-klon er nøglen til dannelse af infektiøs DNA eller RNA positiv-strengede RNA-vira, men det bliver en betydelig teknisk udfordring som størrelsen af det virale genom stiger. 9-17 Især et stort RNA-genom på ~ 10 -32 kb præsenteres tre vigtige hindringer for kloning af et fuldlængde-cDNA funktionelle. 18 Det første problem er syntesen af en trofast cDNA-kopi, eftersom nøjagtigheden af RT-PCR er omvendt proportional med længden af det virale RNA. Den anden hurdle er tilstedeværelsen af potentielt toksiske sekvenser, idet lange RNA-molekyler er mere tilbøjelige til at indeholde uventede sekvenser er i stand til at gøre cDNA-fragmentet i plasmider ustabile i E. coli. Den tredje og mest kritiske spørgsmål er tilgængeligheden af ​​en egnet vektor, da det er vanskeligt at finde en kloningsvektor, der kan rumme en viral cDNA insert på 10 kb&gt;. I løbet af de seneste tre årtier, har disse barrierer overvundet af flere fremskridt inden enzymologi, metode, end vectorology. 1,4,5,8 Af disse er den mest lovende og nyskabende udvikling er kloning af store positive-RNA-vira som smittefarlige bakterielle kunstige kromosomer (BAC&#39;er). BAC vektor er en kloning lav kopi plasmid (1-2 kopier / celle) baseret på E. coli fertilitet faktor, med en gennemsnitlig DNA-insert størrelse på ~ 120-350 kb 19-21 Et DNA-fragment indsættes i BAC vektor i en lignende måde til kloning i generelle kloningsvektorer.; de resulterende BAC kloner er stabile over mange generationer i E. coli. 22,23 Til dato har BAC teknologien blevet brugt til at skabe infektiøse cDNA kloner for&gt; 10 medlemmer af tre positiv-RNA-virus familier, dvs. Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 og Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32 Brug japansk hjernebetændelse virus (JEV) som et eksempel, den nuværende arbejde rapporterer de detaljerede procedurer, der kan væreanvendes til at konstruere et genetisk stabile fuld længde infektiøse BAC for en række positive-strengede RNA-vira. JEV er en zoonotisk flavivirus 33, der overføres i naturen mellem fugle, svin og andre hvirveldyr af myg vektorer. 34,35 Hos mennesker kan JEV infektion kan forårsage den alvorlige ofte dødelig neurologisk sygdom japansk hjernebetændelse (JE), 36, der forekommer i Asien og dele af det vestlige Stillehav, 37,38 med en anslået årlig incidens af ~ kliniske 50,000-175,000 sager. 39,40 Genomet af JEV er en ~ 11 kb, enkeltstrenget, positiv-sense RNA-molekyle og består af en enkelt åben læseramme (ORF) flankeret af to ikke-kodende regioner (NCRs) ved 5&#39;- og 3&#39;-enderne. 41,42 ORF&#39;en koder for et polyprotein, som spaltes af vært og virale proteaser for at generere 10 individuelle proteiner, betegnet C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B og NS5 i N- til C-terminal retning. 34,43,44 Også en eXtended form for NS1 (NS1 &#39;) er udtrykt ved -1 ribosomale frameshifting ved codon 8-9 af NS2A. 45,46 Af disse 11 proteiner, de tre strukturelle proteiner (C, bevægelseshæmmede og E) er af afgørende betydning for dannelsen af infektiøse virioner, 47,48 og de ​​resterende otte ikke-strukturelle proteiner (NS1 til NS5 og NS1 &#39;) er afgørende for virus-RNA replikation, 49-51 partikel samling, 52-56 og medfødte immunitet unddragelse. 57-59 Både 5&#39; og 3 &#39;NCRs indeholder konserverede primære sekvenser og form, RNA sekundær / tertiær strukturer, 60-62 som er vigtige for modulering af viral RNA-replikation. 63,64 Denne protokol beskriver de værktøjer, metoder og strategier til at generere en fuld-længde infektiøse BAC af JEV SA 14 -14-2. 28 Denne funktionelle BAC-klon indeholder en komplet cDNA kopi af JEV genomisk RNA, 65, der er omfattet af en promotor for SP6 RNA polymerase opstrømsaf det virale 5&#39;-enden og et unikt Xbal restriktionssted nedstrøms for den virale 3&#39;-enden til in vitro afstrømning transkription. Denne BAC teknologi kan anvendes til at konstruere en fuldt funktionel cDNA molekylære klon for en bred vifte af positiv-strengede RNA-vira.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">1. Molecular Cloning</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2xYT Broth</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">Y2377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">[3H]UTP</td>
			<td style="width:275px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:243px;">NET380250UC</td>
			<td>Radioactive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">50-mL Tube</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific (Nalgene)</td>
			<td style="width:243px;">3114-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">250-mL Bottle</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:243px;">50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose (Low Melting Point)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvaI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0152S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvrII</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0174S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BamHI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsiWI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsrGI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Butanol</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">A399-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cap Analog [m7G(5&#697;)ppp(5&#697;)A]</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">S1405S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">BP1595-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloroform</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C2432</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">DE-81 Filter Paper</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">3658-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18427-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">E. coli DH10B&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18297-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">EDTA</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7637</td>
			<td>Toxic and highly mutagenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">A6283</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Roche</td>
			<td style="width:243px;">10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">I9392</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0918</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">LB Broth</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lithium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Mung Bean Nuclease</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Needle (18G, 20G)</td>
			<td style="width:275px;">BD</td>
			<td style="width:243px;">305196, 305175</td>
			<td>Biohazardous (Sharps waste)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">NotI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Oligonucleotide</td>
			<td style="width:275px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:243px;">Custom Oligonucleotide Synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">PacI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">pBeloBAC11</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol (Buffer-Saturated)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15513-039</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15593-031</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Guanidine Isothiocyanate</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Ambion)</td>
			<td style="width:243px;">10296-010</td>
			<td>Toxic, corrosive, and irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Pme I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">rNTP Set</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">27-2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sealable Polypropylene Tube (16 &#215; 76 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">342413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SfiI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0123S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sma I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SP6 RNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0207S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Spin Column (Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Syringe</td>
			<td style="width:275px;">HSW NORM-JECT</td>
			<td style="width:243px;">4200.000V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tris</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">tRNA (yeast)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">XbaI&#160;</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2. Cell Culture</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Alpha Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">12561-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Conical Tube (50 mL)</td>
			<td style="width:275px;">VWR</td>
			<td style="width:243px;">21008-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Crystal Violet&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Culture Dish (150 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">93150&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cuvette (2-mm Gap)</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">450125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">F1635</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">61100-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Six-Well Plate</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vitamins</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:275px;">Mupid</td>
			<td style="width:243px;">MPDEXU-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">Heracell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Desktop Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Electroporator</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td>
			<td style="width:275px;">UVP</td>
			<td style="width:243px;">UVGL-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">368826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:243px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vortexer</td>
			<td style="width:275px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:243px;">G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Water Bath</td>
			<td style="width:275px;">Jeio Tech</td>
			<td style="width:243px;">WB-10E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

For alle positive-strengede RNA-virusser, pålideligheden og effektiviteten af en revers genetik systemet afhænger genetiske stabilitet af et klonet fuldlængde-cDNA, hvis sekvens svarer til konsensussekvensen af viralt genomisk RNA. 27 Figur 1 viser en fem- trin for konstruktionen af et fuldlængde-infektiøs cDNA som BAC for JEV SA 14 -14-2 28: Trin 1, oprensning af virus-RNA fra cellekultursupernatanten af JEV-inficerede BHK-21 celler (figur 1A); Trin 2, syntese af fire overlappende cDNA amplikoner (F1 til F4), der dækker hele virusgenomet (figur 1B); Trin 3, subkloning af hver af de fire sammenhængende cDNA-fragmenter i en BAC-vektor, hvilket skaber pBAC / F1 til pBAC / F4 (figur 1C); Trin 4, ændring af de klonede cDNA&#39;er for in vitro afstrømning transskription med SP6 RNA-polymerase, dvs at placere en SP6promotorsekvensen umiddelbart opstrøms for den virale 5&#39;-enden (pBAC / F1 SP6), hvilket eliminerer en forud eksisterende interne XbaI-sitet ved nukleotid 9131 ved at indføre en tavs punktmutation, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), og indsættelse en ny kunstig Xbal afstrømning sted umiddelbart nedstrøms for den virale 3&#39;-enden (pBAC / F4 RO) (figur 1D); og trin 5, samling af et fuldlængde SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (figur 1E). Tabel 1 viser de anvendte oligonukleotider i denne kloningsprocedure. 28 Til konstruktion af et funktionelt JEV cDNA, det første vigtige skridt er syntesen af de fire overlappende cDNA-fragmenter under anvendelse af det oprensede virus-RNA som en skabelon til RT-PCR. Figur 2 giver et repræsentativt resultat for de fire RT-PCR-produkter, der var elektroforese på en 0,8%agarosegel. Denne gel viser klart, at en fuld-længde cDNA JEV forstærkes i fire overlappende cDNA-fragmenter. Lejlighedsvis, kan RT-PCR-reaktioner, hvilket gav en eller flere yderligere virusspecifikke eller uspecifikke produkter, er for det meste mindre end det forventede produkt, på grund af den ikke-specifikke annealing af primere under cDNA-syntese / amplifikation. På den anden side, lidt eller ingen forventede RT-PCR produkt ville blive forstærket på grund af utilsigtet RNase kontaminering under den virale RNA-isolering eller ukorrekt RT-PCR resultater. Den næste tast trin er kloningen og ændring af en ikke- selvstændigt eller fuld længde JEV cDNA i BAC, hvilket er en relativt enkel procedure, der bruger standard rekombinant DNA-teknikker. 69 Figur 3 viser et repræsentativt resultat for oprensning af BAC klon indeholdende en fuld-længde cDNA af JEV SA 14 -14-2 ved banding i en CsCI-EtBr-gradient.I dette eksperiment efter centrifugering i 16 timer ved 401.700 x g, to distinkte bånd, dvs. E. coli kromosomalt DNA ovenfor og det supersnoede plasmid-DNA BAC nedenfor, er synlige i midten af røret under langbølget ultraviolet lys. En minimal volumen (~ 400 ul) af det nedre BAC DNA-bånd blev forsigtigt opsamlet ved at stikke et hul med en sprøjte på siden af ​​røret. Efterfølgende blev EtBr ekstraheret fra BAC DNA&#39;et ved butanolekstraktion, og EtBr-fri BAC DNA blev koncentreret ved ethanolpræcipitation. Det sidste trin er bestemmelse af den specifikke smitsomhed af de syntetiske RNA&#39;er transskriberet in vitro fra fuld-længde SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) efter RNA transfektion i tolerante celler (figur 4). Dette trin involverer tre sekventielle trin: Trin 1, linearisering af fuld længde SA 14 -14-2 cDNA ved 3&#39;-enden af det virale genom (figur 4A); Trin 2, produktion af syntetiske RNA&#39;er fra det lineariserede cDNA ved afstrømning transkription (figur 4B); og Trin 3, redning af de rekombinante vira i BHK-21-celler transficeret med de syntetiske RNA&#39;er (figur 4C). Eksperimentelt blev to uafhængige kloner af pBAC / SA 14 -14-2 lineariseret med Xbal fordøjelse og behandlet med MBN at fjerne de fire-base-5&#39;-overhæng genereret af XbaI fordøjelse. De lineariserede BAC&#39;er blev renset ved phenol-chloroform-ekstraktion efterfulgt af ethanolfældning. Linearisering af de to oprensede BAC&#39;er blev demonstreret på en 0,8% agarosegel (figur 5A). Phenol-chloroform-ekstraktion skal udføres omhyggeligt for at sikre, at de lineariserede BAC&#39;er er RNase-fri. Hver af de to lineariserede BAC&#39;er tjente som en skabelon for cDNA afstrømning transskription under anvendelse af SP6 RNA-polymerase i nærvær af m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) En hætte analog. Integriteten af de syntetiske RNA&#39;er blev vist ved at køre prøver af de to transskription reaktionsblandinger på en 0,6% agarosegel, sammen med en reference 1 kb DNA-stige (figur 5B). I denne enkle assay større fremtrædende RNA band altid migrerede lige under de 3 kb referere DNA-bånd og syntes at være skarpe. Imidlertid nedbrydes RNA ville have en smurt udseende på den samme gel. En smitsom center analysen er den gyldne standard for at bestemme den specifikke smitsomhed af de syntetiske RNA&#39;er. Dette assay blev udført ved elektroporering BHK-21 celler med RNA-prøver, podning lige portioner af 10-fold seriefortyndet elektroporerede celler i 6-brønds plader indeholdende naive BHK-21-celler (3 x 10 5 celler / brønd), og overlejring agarose på cellemonolagene. Efter inkubation i 4 dage blev overlevende celler fikseret med formaldehyd og farves med et krystalviolet solution at kvantificere antallet af infektiøse centre (plaques), hvilket svarer til antallet af infektiøse RNA-molekyler, der leveres ind i cellerne (figur 6A). Da cDNA skabelon til in vitro-transkription har vist sig at være ikke-infektiøse, blev 27 en alikvot af transskription reaktionsblandingen anvendes direkte til elektroporation. Elektroporation er den foretrukne metode til transfektion RNA; Alternativt kan RNA&#39;er transficeres ved andre metoder under anvendelse af DEAE-dextran og kationiske liposomer. RNA elektroporering er meget effektiv, men &quot;buedannelse&quot; af den elektriske impuls sjældent forekommer, hvis salte er til stede i elektroporation reaktion eller hvis elektroporation cuvette genbruges. Ekspressionen af virale proteiner i RNA-transficerede celler blev undersøgt ved immunofluorescensassays anvendelse af et anti-NS1 kaninantiserum (figur 6B). Produktionen af ​​virale partikler akkumuleret i supernatanterne af RNA-transficerede celler var enalyzed ved plaque-assays (figur 6C). Resultaterne af disse forsøg viser klart, at de cDNA-afledte syntetiske RNA&#39;er er infektiøse i tolerante BHK-21 celler, der genererer en høj titer af rekombinante vira. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide </td><td> Sekvens a (5 &#39;til 3&#39;) </td><td> Position b </td><td> Polaritet </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td> Følelse </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> MyreiSense </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Følelse </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Følelse </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10.952-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Følelse </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ta </td><td></td><td> Følelse </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Følelse </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Følelse </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Følelse </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisense </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10.670-10.694 </td><td> Følelse </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10.954-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td colspan="4"> et JEV sekvenser er vist med store bogstaver, og BAC-sekvenser er angivet med små bogstaver. b nucleotidposition refererer til det komplette genom sekvens af JEV SA 14 -14-2 (Genbank JN604986). </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Oligonukleotider anvendt til cDNA-syntese, PCR-amplifikation og BAC mutagenese. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figur 1.0; for konstruktionen af et fuldlængde-cDNA af JEV SA 14 -14-2 som BAC (A) Isolering af viralt RNA fra JEV partikler.. Vist er et skematisk diagram af den genomiske RNA af JEV SA 14 -14-2. (B) Syntese af fire overlappende cDNA-fragmenter (F1 til F4), der dækker hele det virale genom. (C) Subkloning af fire overlappende cDNA-fragmenter i en BAC-vektor, hvilket skaber pBAC / F1 til pBAC / F4. (D) Ændring af de klonede cDNA&#39;er for afstrømning transskription in vitro. pBAC / F1 SP6 er et derivat af pBAC / F1, der indeholder SP6 promotorsekvensen opstrøms for den virale 5&#39;-enden. pBAC / F3 KO er et derivat af pBAC / F3, der indeholder en tavs punktmutation (A 9134 → T, asterisk). pBAC / F4 RO er et derivat af pBAC / F4, der indeholder en kunstig Xbal afstrømning nedstrøms af det virale 3&#39;-enden. (E </<html> strong&gt;) Montering af en fuld-længde SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Figur 2. Syntese af fire overlappende cDNA-fragmenter (F1 til F4) spænder fuldlængde genomisk RNA fra JEV SA 14 -14-2. De fire RT-PCR-produkter bedømmes ved elektroforese i en 0,8% agarosegel. M, 1 kb DNA-stige. De forventede størrelser af de fire cDNA fragmenterne er angivet i bunden af gelen billedet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3. Oprensning af BAC, der indeholder en fuld-længde cDNA af JEV SA 14 -14-2. Er BAC plasmid isoleret fra E. coli DH10B af SDS-alkalisk lyse fremgangsmåde og yderligere oprenset ved banding i en CsCI-EtBr-gradient. Præsenteret er et eksempel på den CsCI-EtBr gradient ved hjælp af en 16 × 76 mm rør forsegles polypropylen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Figur 4. Oversigt over inddrivelse af smitsomme vira fra en fuld-længde JEV SA 14 -14-2 cDNA samlet i en BAC. (A) Linearisering af cDNA skabelon. Fuldlængde JEV BAC skæres medXbal og behandlet med MBN. (B) Syntese af RNA-transkripter. Det lineariserede cDNA transskriberet af SP6 RNA-polymerase i nærvær af m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) En hætte analog. (C) Inddrivelse af det syntetiske JEVs. In vitro transskriberede RNA er transficeret i BHK-21 celler ved elektroporation, som genererer en høj titer af syntetisk virus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figur 5. Syntese af RNA&#39;erne ved in vitro transcription under anvendelse af en fuld-længde JEV BAC som cDNA skabelon. (A) Fremstilling af den lineariserede fuld længde JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. To uafhængige kloner af pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 og Cl.2) lineariseres ved fordøjelse med Xbal og efterfølgende behandling med MBN. De lineariserede BAC&#39;er undersøges ved elektroforese i en 0,8% agarosegel. (B) Fremstilling af de syntetiske RNA&#39;er ved afstrømning transskription. Hver af de to lineariserede BAC&#39;er anvendes som en skabelon for SP6-RNA-polymerase afstrømning transkription. Portioner af de to transcription reaktioner kørt på en 0,6% agarosegel. M, 1 kb DNA-stigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figur 6. Specifik infektivitet af de syntetiske RNA&#39;er transskriberet fra en fuld-længde JEV BAC og nyttiggørelse af syntetisk virus. BHK-21 celler er mock-elektroporeret (Mock) eller elektroporeret med de RNA-transkripter afledt from hver af de to uafhængige kloner af fuld længde JEV BAC (Cl.1 og Cl.2). (A) RNA infektivitet. Cellerne overlejret med agarose og farvet med krystalviolet 4 dage efter transfektion. RNA-infektivitet bestemmes af smitsomme center analyser til at estimere mængden af ​​infektiøst RNA elektroporeret ind i cellerne (venstre panel). Desuden er repræsentative billeder af infektiøse centre vist (højre panel). (B) Protein ekspression. Cellerne dyrkes i 4-brønds kammerobjektglas. Viralt protein ekspression i RNA-elektroporeret celler ved 20 timer post-transfektion (HPT) analyseres ved immunofluorescensassays anvendelse af en primær anti-NS1 kaninantiserum og et sekundært Cy3-konjugeret gede anti-kanin IgG (rød). Kernerne er modfarvet med 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindol (blå). Immunofluorescens billeder overlejres på deres tilsvarende differentielle interferenskontrastudstyr billeder. (C) Virus udbytte. Cellerne dyrkes i 150 mm dyrkningsskåle. Produktionen af infektiøse virioner akkumuleret i dyrkningssupernatanterne af RNA-elektroporerede celler ved 22 og 40 HPT undersøges af plakanalyser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakteriel kunstige kromosomer: En funktionel Genomics værktøj for Studiet af Positiv-RNA-vira

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Isolering og genom analyse af enkelte Virioner benytter &quot;enkelt virus Genomics &#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering af en Liquid-dækket kultur Polarized humane luftveje Epitelial Calu-3-celler til at studere Host celle respons på luftvejspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk Manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammer til Functional Genomisk Analyse af<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Efter i Real Time konsekvenserne af Pneumokok virulensfaktorer i en akut Mouse Lungebetændelse Model Brug Bioluminescent Bakterier

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Afsløring glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodic Acid Schiff Farvning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Elektroporation af funktionelle Bakterielle effektorer i pattedyrceller

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration af rekombinant influenzavacciner i kimære musemodeller at studere slimhindeimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...