Name: bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.

The authors have declared that they have no competing financial interests.

Het huidige protocol is met succes gebruikt om full-length infectieuze cDNA-klonen van twee verschillende stammen (CNU / LP2 SA 27 en 14 -14-2 28) van JEV, een flavivirus waarvan de functionele cDNA bleek inherent moeilijk samen te stellen is en genereren propageren vanwege toxiciteit gastheercel en de genetische instabiliteit van gekloneerde cDNA 8,74-76 Dit protocol omvat drie hoofdcomponenten. eerste, het maximaliseren van de synthese / amplificatie van cDNA een getrouwe kopie van het virale RNA met behulp van high-fidelity reverse transcriptase / DNA polymerase; tweede, het kloneren van de virale prM-E coderend gebied dat toxische sequenties (ongepubliceerde gegevens) 74,77,78 in een zeer lage kopieaantal vector BAC uit de oorspronkelijke cDNA subkloneren tot de uiteindelijke volledige lengte cDNA montagestappen; en de derde, gebruik van een kloneringsvector die BAC kan een vreemd DNA met een gemiddelde grootte van 120-350 kb, 19-21 die blijkbaar tolereert grotere DNA inserts dan andere kloneringsvectoren. Deze klonering wordt algemeen toepasbaar op vele andere positieve streng RNA-virussen, met name die met een groot RNA-genoom van ~ 10 tot 32 kb. Genereren van een infectieuze cDNA-kloon is een belangrijke stap in de ontwikkeling van een reverse genetics voor RNA-virussen, met name positieve streng RNA-virussen, omdat het genoom treedt virale mRNA dat vertaald in eiwitten door gastheercel ribosomen. Aldus kan virale replicatie worden gestart door de introductie van een cDNA-afgeleide genoom-lengte RNA molecuul in een vatbare gastheercel. De beschikbaarheid van een infectieus JEV cDNA-kloon, in combinatie met recombinant DNA-technologie, heeft ons begrip van verschillende aspecten van de virale levenscyclus verhoogd op moleculair niveau, zoals genexpressie 73,79 en genoomreplicatie. 63,64 ook een full-length JEV cDNA-kloon blijkt een waardevol instrument voor de ontwikkeling van antivirale vaccins 28 en gentherapie vectoren. &lt;sup&gt; 80,81 Zoals bij alle positieve streng RNA virussen er meerdere kritische stappen bij het ​​construeren van een betrouwbare functionele cDNA voor JEV waaruit zeer besmettelijke RNAs kunnen worden gesynthetiseerd in vitro. Idealiter zou de sequentie van de synthetische RNA getranscribeerd van een kloon van volledige lengte cDNA identiek zijn aan die van het virale genomische RNA, met name de 5&#39;- en 3&#39;-terminale sequenties die nodig zijn voor de initiatie van virale RNA replicatie . 60-62 In het huidige protocol, de authentieke 5&#39;- en 3&#39;-uiteinden werden verzekerd door het plaatsen van de SP6-promotersequentie stroomopwaarts van de eerste adenine nucleotide van het virale genoom en positioneren van een unieke kunstmatige XbaI-restrictieplaats stroomafwaarts van de laatste thymine nucleotide van het virale genoom, respectievelijk. Capped synthetische RNAs met authentieke 5 &#39;en 3&#39; uiteinden werden geproduceerd door run-off transcriptie van een XbaI-gelineariseerd en MBN behandelde cDNA template gebruik SP6 RNA polymerase geprimed met m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Dop analoog. Dit protocol kan worden gemodificeerd op verschillende manieren. Voor in vitro transcriptie kan een bacteriofaag RNA-polymerase (bijvoorbeeld T3 of T7) worden gebruikt in combinatie met een goed gedefinieerde promotorsequentie. 27 als run-off site, kan een andere restrictieplaats worden toegepast als het niet presenteren het virale genoom en als synthetische RNA van de gelineariseerde cDNA eindigt met de authentieke 3 &#39;uiteinde. Het belang van het 3&#39;-uiteinde nucleotidesequentie werd aangetoond door een ~ 10-voudige afname in infectiviteit RNA wanneer een synthetisch RNA bevat drie of vier-verbonden-virus nucleotiden aan het 3 &#39;uiteinde. 27 In een in vitro transcriptie reactie, zowel de m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A en m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G cap analoog kan evengoed gebruikt, hoewel deze plaatsen een ongerelateerde extra G nucleotide stroomopwaarts van het virale 5 &#39;-end, maar datBovendien neemt niet weg infectiviteit of replicatie van synthetisch RNA. 27 Bovendien is het verwijderen van de matrijs cDNA van het RNA transcripten met DNase I digestie is niet noodzakelijk RNA infectiviteit testen, omdat de cDNA sjabloon zelf is niet besmettelijk. 27 De BAC-technologie is nu toegepast op de bouw van infectueuze cDNA-klonen voor een handvol positieve streng RNA-virussen, namelijk twee JEVs, CNU / LP2 27 en SA 14 -14-2 28 (genoomgrootte, ~ 11 kb); twee dengue virussen, BR / 90, 26 en NGC 29 (~ 11 kb); het bovine virale diarree virus, SD1 (~ 12 kb), 25 twee klassieke varkenspest virussen, C en Paderborn (~ 12 kb), 24 de border disease virus, Gifhorn (~ 12 kb), 24 het porcien reproductief en respiratoir syndroom virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 de overdraagbare gastro-enteritis virus, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 de feline infectieuze peritonitis virus,DF-2 (~ 29 kb); 32 het Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus, Urbani (~ 30 kb); 9 het Midden-Oosten respiratoir syndroom coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), 17 en het menselijk coronavirus, OC43 (~ 31 kb) 31 Het belangrijkste voordeel van het gebruik van BAC&#39;s voor cDNA constructie is het hoge genetische stabiliteit van de grote, 1- of 2-kopie plasmiden BAC.; De intrinsieke aard van zijn extreem lage aantal kopieën is ook een groot nadeel, omdat zeer lage opbrengsten van BAC DNA en de daaruit voortvloeiende verlaging van de zuiverheid van het BAC DNA opzichte van chromosomaal DNA gastheer. In het huidige protocol is de opbrengst van BAC DNA gemaximaliseerd door groeiende E. coli DH10B getransformeerd met de besmettelijke BAC pBAC / SA 14 -14-2 in een voedselrijke medium, 2xYT. Dit neemt de gemiddelde opbrengst slechts ~ 15 pg BAC DNA van 500 ml 2xYT bouillon. Tevens is de zuiverheid van het BAC DNA best bereikt door CsCl-dichtheidsgradiënt centrifugatie EtBr voor zuiveringIn plaats van de gebruikelijke kolommen gebaseerde plasmide-isolatie. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat de BAC-getransformeerde E. coli mag niet overwoekeren, omdat het de genetische stabiliteit van het gekloonde cDNA in gevaar kan brengen, en een hogere groei leidt niet noodzakelijk tot een grotere opbrengst of hogere zuiverheid BAC DNA. De hier beschreven protocol is een geoptimaliseerde, efficiënte en gestroomlijnde werkwijze voor de constructie en vermeerdering van een genetisch stabiele full-length infectueuze cDNA-kloon als een BAC voor JEV, een procedure ooit gedacht praktisch onmogelijk. Dezelfde klonen strategie kan ook worden toegepast op vele andere positieve streng RNA virussen. In het algemeen infectieuze cDNA-klonen kunnen wij verschillende mutaties (bijvoorbeeld deleties, inserties en puntmutaties) introduceren in een viraal RNA-genoom van hun biologische functies te bestuderen virale replicatie en pathogenese. Deze cDNA-gebaseerde reverse genetics systeem maakt het mogelijk om de ontwikkeling en test vaccins en therapeutische kandidaten richten een virulentiefactor (en) van een bepaalde positieve streng RNA-virus van belang. Bovendien kan deze infectieuze cDNA techniek ook worden gebruikt als een virale vector, in staat is tot expressie van een vreemd gen (en) van belang voor vele toepassingen in biomedisch onderzoek.

Voor RNA virologen de komst van recombinant DNA technologie in de late jaren 1970 maakte het mogelijk om virale RNA-genomen om te zetten in cDNA-klonen, die vervolgens kan worden vermeerderd zoals plasmiden in bacteriën voor de genetische manipulatie van RNA-virussen. 1 het eerste RNA-virus te zijn moleculair gekloond was bacteriofaag Qp, een positieve streng RNA virus dat Escherichia coli infecteert. Een plasmide dat een volledige cDNA kopie van de Qp-genoom RNA leidde tot infectieuze fagen QP wanneer ingebracht in E. coli. 2 Kort daarna deze techniek werd toegepast op poliovirus, een positieve streng RNA-virus van mens en dier. Een plasmide dat een cDNA van volledige lengte van het poliovirus genomische RNA infectieus wanneer getransfecteerd in zoogdiercellen en staat de productie van infectieuze virions 3 In deze &quot;-DNA geïntroduceerd&quot; werd de gekloneerde cDNAs moeten intracellulair getranscribeerd virale RNA replicatie te initiëren.;het is echter onduidelijk hoe de transcriptie wordt geïnitieerd en hoe de transcripten worden verwerkt om de juiste virale sequentie. Deze bezorgdheid heeft geleid tot de ontwikkeling van een alternatieve &quot;-RNA gestart&quot; benadering, waarbij een volledige cDNA-kopie van het virale RNA-genoom is gekloneerd onder een promoter herkend door een E. coli of faag RNA-polymerase voor het produceren van synthetische RNA&#39;s in vitro met gedefinieerde 5 &#39;en 3&#39; uiteinden, waarbij de volledige virale replicatiecyclus ondergaan wanneer ingebracht in gastheercellen. 4,5 Het eerste succes van deze benadering werd gerapporteerd brome mosaic virus 6,7 een positieve streng RNA-virus van planten. Sindsdien is de RNA-gelanceerd aanpak ontwikkeld voor een breed scala aan positieve streng RNA-virussen, waaronder calicivirussen, alfavirussen, flavivirussen, arterivirussen en coronavirussen. 1,4,5,8 In zowel de DNA- en RNA-gelanceerde reverse genetics systemen, de bouw van een vl-cDNA-kloon is de sleutel tot het genereren van infectieus DNA of RNA van positieve streng RNA virussen, maar het wordt een aanzienlijke technische uitdaging als de grootte van het virale genoom toeneemt. 17/09 met name een groot RNA-genoom van ~ 10 -32 kb bevat drie belangrijke obstakels voor het klonen van een full-length cDNA functioneel. 18 Het eerste probleem is de synthese van een cDNA getrouwe kopie, aangezien de betrouwbaarheid van RT-PCR is omgekeerd evenredig met de lengte van het virale RNA. De tweede hindernis is de aanwezigheid van potentieel toxische sequenties, al lang RNA moleculen vaker onverwachte sequenties die in staat is de cDNA-fragment in onstabiele plasmiden in E. bevatten coli. De derde en meest kritische punt is de beschikbaarheid van een geschikte vector, aangezien het moeilijk is een kloneringsvector die een virale cDNA-insert van&gt; 10 kb kunnen onderbrengen vinden. In de afgelopen drie decennia hebben deze barrières overwonnen door een aantal ontwikkelingen in de enzymologie, methodologie, eend vectorology. 1,4,5,8 Van deze, de meest veelbelovende en innovatieve ontwikkeling is het klonen van grote positieve streng RNA-virussen zoals besmettelijke bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC). De BAC vector is een low-copy klonen plasmide (1-2 kopieën / cel) op basis van de E. coli vruchtbaarheid factor, met een gemiddelde grootte van insert DNA ~ 120-350 19-21 kb DNA-fragment wordt in de BAC vector op een gelijkaardige manier ingevoegd kloneren in algemene kloneringsvectoren.; de verkregen BAC klonen stabiel gedurende vele generaties E. coli. 22,23 Tot op heden heeft het RCB technologie gebruikt van infectieuze cDNA-klonen voor&gt; 10 leden van drie positieve streng RNA virus families, namelijk Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 en Coronaviridae creëren. 9,16,17 , 31,32 Met behulp van Japanse encefalitisvirus (JEV) als voorbeeld, dit werk rapporteert de gedetailleerde procedures die kunnen wordengebruikt om een ​​genetisch stabiele full-length infectieuze BAC voor verschillende positieve streng RNA-virussen te construeren. JEV is een zoönotische flavivirus 33 die in de natuur tussen vogels, varkens en andere gewervelde gastheer wordt overgebracht door muggen vectoren. 34,35 Bij mensen JEV infectie kan het ernstige vaak dodelijke neurologische ziekte Japanse encefalitis (JE), 36 die optreedt in Azië en delen van de westelijke Stille Oceaan, 37,38 met een geschatte jaarlijkse incidentie van ~ 50,000-175,000 klinische gevallen. 39,40 Het genoom van JEV is een ~ 11-kb, enkelstrengs, positieve-sense RNA-molecuul en bestaat uit een enkel open leesraam (ORF) geflankeerd door twee niet-coderende regio (NCR) van het 5 &#39;en 3&#39; uiteinden. 41,42 Het ORF codeert voor een polyproteïne dat wordt gesplitst door gastheer en virale proteases tot 10 afzonderlijke eiwitten genereren aangewezen C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B en NS5 in de N- naar C-terminus. 34,43,44 Ook eXtended vorm van NS1 (NS1) wordt door -1 ribosomale frameshifting uitgedrukt in codons 8-9 van NS2A. 45,46 Van deze 11 eiwitten, de drie structurele eiwitten (C, prM en E) zijn essentieel voor de vorming van infectieuze virions, 47,48 en de resterende acht structurele eiwitten (NS1 tot NS5 en NS1 &quot;) zijn noodzakelijk voor virale RNA-replicatie, 49-51 deeltje assemblage, 52-56 en aangeboren immuniteit fraude. 57-59 zowel de 5 &#39;en 3 &#39;NCRs bevatten geconserveerde primaire sequenties en vorm RNA secundaire / tertiaire structuren, 60-62 die belangrijk zijn voor het moduleren van viraal RNA replicatie. 63,64 Dit protocol beschrijft de gereedschappen, werkwijzen en strategieën voor het genereren van een full-length infectieuze BAC van JEV SA 14 -14-2. 28 Deze functionele BAC kloon bevat een volledig cDNA kopie van het RNA genoom JEV, 65 die is omgeven door een promoter de SP6 RNA polymerase upstreamvan de virale 5&#39;-uiteinde en een unieke XbaI-restrictieplaats stroomafwaarts van het virale 3&#39;-end in vitro run-off transcriptie. Deze BAC technologie is toepasbaar op het construeren van een volledig functionele cDNA-kloon moleculaire voor een serie van positieve streng RNA virussen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">1. Molecular Cloning</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2xYT Broth</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">Y2377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">[3H]UTP</td>
			<td style="width:275px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:243px;">NET380250UC</td>
			<td>Radioactive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">50-mL Tube</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific (Nalgene)</td>
			<td style="width:243px;">3114-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">250-mL Bottle</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:243px;">50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose (Low Melting Point)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvaI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0152S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvrII</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0174S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BamHI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsiWI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsrGI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Butanol</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">A399-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cap Analog [m7G(5&#697;)ppp(5&#697;)A]</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">S1405S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">BP1595-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloroform</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C2432</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">DE-81 Filter Paper</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">3658-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18427-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">E. coli DH10B&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18297-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">EDTA</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7637</td>
			<td>Toxic and highly mutagenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">A6283</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Roche</td>
			<td style="width:243px;">10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">I9392</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0918</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">LB Broth</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lithium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Mung Bean Nuclease</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Needle (18G, 20G)</td>
			<td style="width:275px;">BD</td>
			<td style="width:243px;">305196, 305175</td>
			<td>Biohazardous (Sharps waste)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">NotI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Oligonucleotide</td>
			<td style="width:275px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:243px;">Custom Oligonucleotide Synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">PacI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">pBeloBAC11</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol (Buffer-Saturated)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15513-039</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15593-031</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Guanidine Isothiocyanate</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Ambion)</td>
			<td style="width:243px;">10296-010</td>
			<td>Toxic, corrosive, and irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Pme I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">rNTP Set</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">27-2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sealable Polypropylene Tube (16 &#215; 76 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">342413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SfiI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0123S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sma I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SP6 RNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0207S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Spin Column (Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Syringe</td>
			<td style="width:275px;">HSW NORM-JECT</td>
			<td style="width:243px;">4200.000V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tris</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">tRNA (yeast)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">XbaI&#160;</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2. Cell Culture</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Alpha Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">12561-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Conical Tube (50 mL)</td>
			<td style="width:275px;">VWR</td>
			<td style="width:243px;">21008-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Crystal Violet&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Culture Dish (150 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">93150&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cuvette (2-mm Gap)</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">450125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">F1635</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">61100-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Six-Well Plate</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vitamins</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:275px;">Mupid</td>
			<td style="width:243px;">MPDEXU-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">Heracell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Desktop Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Electroporator</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td>
			<td style="width:275px;">UVP</td>
			<td style="width:243px;">UVGL-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">368826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:243px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vortexer</td>
			<td style="width:275px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:243px;">G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Water Bath</td>
			<td style="width:275px;">Jeio Tech</td>
			<td style="width:243px;">WB-10E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Voor alle positieve streng RNA-virussen, de betrouwbaarheid en efficiëntie van reverse genetics systeem afhankelijk van de genetische stabiliteit van een gekloneerde cDNA van volledige lengte, waarvan de sequentie overeenkomt met de consensus sequentie van viraal genoom RNA. 27 Figuur 1 toont een vijf- stap strategie voor de constructie van een full-length infectieus cDNA als een BAC voor JEV SA 14 -14-2 28: Stap 1, zuivering van viraal RNA uit de celkweek supernatant van JEV geïnfecteerde BHK-21-cellen (Figuur 1A); Stap 2 synthese van vier overlappende cDNA-amplicons (F1 tot F4) verspreid over de hele virale genoom (Figuur 1B); Stap 3, subkloneren van elk van de vier aangrenzende cDNA fragmenten in een BAC vector creëren pBAC / F1 tot pBAC / F4 (figuur 1C); Stap 4, wijziging van de gekloneerde cDNA&#39;s in vitro run-off transcriptie met SP6 RNA polymerase, dat wil zeggen, het plaatsen van een SP6promoter sequentie direct stroomopwaarts van de virale 5&#39;-uiteinde (pBAC / F1 SP6), waardoor een bestaand inwendige XbaI bij nucleotide 9131 door invoeging van een stille puntmutatie, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), en invoegen een nieuwe kunstmatige XbaI- run-off site onmiddellijk stroomafwaarts van het virale 3&#39;-end (pBAC / F4 RO) (figuur 1D); en stap 5, samenstel van een full-length SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (figuur 1E) tabel. 1 worden de oligonucleotiden in deze kloneringswerkwijze. 28 Voor de constructie van een functionele JEV cDNA, de eerste belangrijke stap is de synthese van de vier overlappende cDNA-fragmenten met gezuiverde virale RNA als een matrijs voor RT-PCR. Figuur 2 geeft een representatief resultaat voor de vier RT-PCR producten die werden geëlektroforeerd op een 0,8%agarosegel. Deze gel blijkt duidelijk dat een full-length JEV cDNA wordt geamplificeerd in vier overlappende cDNA-fragmenten. Soms kan RT-PCR reacties op één of meer additionele virus-specifieke of niet-specifieke producten die meestal kleiner is dan het verwachte product, vanwege de niet-specifieke hybridisatie van de primers tijdens cDNA-synthese / amplificatie. Anderzijds, weinig of geen verwachte RT-PCR produkt zou worden versterkt door RNase toevallige besmetting tijdens het virale RNA isolatie of onjuist RT-PCR prestaties. De volgende belangrijke stap is het kloneren en aanpassen van een partiële of volledige lengte JEV cDNA in BAC, wat een relatief eenvoudige procedure die standaard recombinant DNA technieken gebruikt. 69 Figuur 3 toont een representatief resultaat voor de zuivering van de BAC kloon die een volledige lengte cDNA van JEV SA 14 -14-2 door strepen in een CsCl-EtBr verloop.In dit experiment werd na centrifugatie gedurende 16 uur bij 401.700 x g, twee verschillende banden, dat wil zeggen, de E. coli chromosomaal DNA boven en sterk gedraaide BAC plasmide-DNA hieronder, zijn zichtbaar in het midden van de buis onder langgolvig ultraviolet licht. Een minimale volume (~ 400 ul) van de onderste BAC DNA-band werd zorgvuldig verzameld door prikken van een gat met een spuit op de zijkant van de buis. Vervolgens de EtBr werd uit de BAC DNA door butanolextractie en de EtBr vrije BAC DNA werd geconcentreerd door ethanolprecipitatie. De laatste stap is het bepalen van de specifieke infectiviteit van de synthetische RNA&#39;s in vitro getranscribeerd vanaf de full-length SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) na RNA-transfectie in gevoelige cellen (Figuur 4). Deze stap omvat drie opeenvolgende stappen: Stap 1, linearisatie van de full-length SA 14 -14-2 cDNA aan het 3&#39;-einde van het virale genoom (Figuur 4A); Stap 2, de productie van synthetische RNA&#39;s van de gelineariseerde cDNA door de run-off transcriptie (Figuur 4B); en stap 3, redding van de recombinante virussen in BHK-21-cellen getransfecteerd met de synthetische RNA&#39;s (figuur 4C). Experimenteel twee onafhankelijke klonen van pBAC / SA 14 -14-2 werden gelineariseerd met XbaI digestie en behandeld met MBN de vier basen 5 &#39;overhang die door het XbaI-digestie verwijderd. De gelineariseerde BACs werden gereinigd door fenol-chloroform extractie gevolgd door ethanol precipitatie. De linearisatie van de twee gezuiverde BACs werd gedemonstreerd op een 0,8% agarosegel (Figuur 5A). De fenol-chloroform extractie moet zorgvuldig gebeuren zodat het gelineariseerde BACs zijn RNase-free. Beide gelineariseerde BACs diende als een template voor cDNA run-off transcriptie met behulp SP6 RNA polymerase in aanwezigheid van de m 7 G (5 &#39;) ppp (5) Dop analoog. De integriteit van de synthetische RNA&#39;s werd aangetoond door het uitvoeren van aliquots van de twee transcriptie-reactiemengsels op een 0,6% agarose gel, samen met een referentie 1 kb DNA ladder (Figuur 5B). In deze eenvoudige bepaling, de belangrijkste prominente RNA band altijd slechts migreerde onder de 3 kb DNA-band en leek scherp te zijn. Echter, gedegradeerd RNA zou uitgesmeerd verschijning op dezelfde gel hebben. Een infectieuze center assay is de gouden standaard voor het bepalen van de specifieke infectiviteit van de synthetische RNA&#39;s. Deze test werd uitgevoerd door electroporating BHK-21 cellen met RNA-monsters, zaaien gelijke hoeveelheden van de 10-voudig serieel verdund geëlektroporeerde cellen in 6-well platen met naïeve BHK-21 cellen (3 x 10 5 cellen / putje), en bedekken agarose op de cel monolagen. Na incubatie gedurende 4 dagen werden de overlevende cellen gefixeerd met formaldehyde en gekleurd met kristalviolet sPLOSSING het aantal infectieuze centra (plaques), dat overeenkomt met het aantal infectieuze RNA-moleculen afgegeven in de cellen (Figuur 6A) te kwantificeren. Aangezien de cDNA template voor in vitro transcriptie bewezen niet besmettelijk, werd 27 een hoeveelheid van de transcriptie reactiemengsel direct gebruikt voor elektroporatie. Elektroporatie is de voorkeurswerkwijze voor transfectie van RNA; Als alternatief kan RNA worden getransfecteerd met behulp van andere werkwijzen DEAE-dextran en kationische liposomen. RNA elektroporatie is zeer effectief, maar &quot;vonkontlading&quot; van de elektrische puls treedt zelden of zouten aanwezig in de elektroporatie reactie of de elektroporatie cuvette wordt hergebruikt zijn. De expressie van virale eiwitten in RNA-getransfecteerde cellen werd onderzocht door immunofluorescentie assays gebruik van een anti-NS1 konijnen antiserum (figuur 6B). De productie van virale deeltjes verzameld in de supernatanten van RNA-getransfecteerde cellen wasalyzed door plaque assays (figuur 6C). De resultaten van deze experimenten tonen duidelijk aan dat de cDNA-afgeleide synthetische RNA infectieus permissief BHK-21-cellen, het genereren van een hoge titer van recombinant virus. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide </td><td> Sequentie een (5 &#39;tot 3&#39;) </td><td> Stand b </td><td> Polariteit </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 22/01 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> Mierik voel </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10.952-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ta </td><td></td><td> Zin </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 14/01 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 17/01 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisense </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10.670-10.694 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10.954-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td colspan="4"> een JEV sequenties worden weergegeven in hoofdletters, en BAC sequenties zijn aangegeven in kleine letters. b Nucleotide positie verwijst naar de volledige genoomsequentie van JEV SA 14 -14-2 (Genbank nummer JN604986). </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Oligonucleotiden gebruikt voor cDNA-synthese, PCR-amplificatie en mutagenese BAC. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figuur 1.0, Strategie voor de constructie van een full-length cDNA van JEV SA 14 -14-2 als BAC (A) Isolatie van viraal RNA van JEV deeltjes.. Getoond is een schematisch diagram van het genomische RNA van JEV SA 14 -14-2. (B) Synthese van vier overlappende cDNA-fragmenten (F1 tot F4) voor de gehele virale genoom. (C) Subklonering van vier overlappende cDNA-fragmenten in een BAC vector, het creëren van pBAC / F1 aan pBAC / F4. (D) Wijziging van de gekloonde cDNA&#39;s voor run-off transcriptie in vitro. pBAC / F1 SP6 is een derivaat van pBAC / F1 de SP6-promotersequentie stroomopwaarts van de virale 5&#39;-uiteinde bevat. pBAC / F3 KO is een derivaat van pBAC / F3 die een stille puntmutatie (A 9134 → T, asterisk) bevat. pBAC / F4 RO is een derivaat van pBAC / F4 dat een kunstmatige XbaI afvloeiing stroomafwaarts van het virale 3&#39;-uiteinde bevat. (E </<html> strong&gt;) Vergadering van een full-length SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Figuur 2. Synthese van vier overlappende cDNA-fragmenten (F1 tot F4) verspreid over de volledige lengte genomische RNA van JEV SA 14 -14-2. De vier RT-PCR producten worden geëvalueerd door elektroforese in een 0,8% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. De verwachte grootte van de vier cDNA-fragmenten worden aangegeven aan de onderkant van het beeld van de gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3. Zuivering van de BAC met een volledige lengte cDNA van JEV SA 14 -14-2. Is de BAC plasmide geïsoleerd uit E. coli DH10B door de SDS-alkalische lysismethode en verder gezuiverd door middel van strepen in een CsCl-EtBr verloop. Gepresenteerd is een voorbeeld van de CsCl-EtBr gradiënt met behulp van een 16 × 76 mm afsluitbare polypropyleen buis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Figuur 4. Overzicht van de terugwinning van infectieuze virussen uit een full-length JEV SA 14 -14-2 cDNA geassembleerd in een BAC. (A) Linearisatie van de cDNA template. De full-length JEV BAC wordt gesneden metXbaI en behandeld met MBN. (B) Bereiding van de RNA-transcripten. De gelineariseerde cDNA getranscribeerd door SP6 RNA polymerase in aanwezigheid van de m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Dop analoog. (C) Herstel van de synthetische JEVs. De in vitro getranscribeerd RNA worden getransfecteerd in BHK-21 cellen door elektroporatie, die een hoge titer van synthetische virus genereert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figuur 5. Synthese van RNA van in vitro transcriptie met behulp van een full-length BAC JEV cDNA als matrijs. (A) Vorming van het gelineariseerde full-length JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. Twee onafhankelijke klonen van pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 en Cl.2) worden gelineariseerd door digestie met XbaI en daaropvolgende behandeling met MBN. De gelineariseerde BACs worden onderzocht door elektroforese in een 0,8% agarosegel. (B) De productie van de synthetische RNA&#39;s door de run-off transcriptie. Beide gelineariseerde BACs wordt gebruikt als een matrijs voor SP6 RNA-polymerase run-off transcriptie. Porties van de twee transcriptie-reacties worden uitgevoerd op een 0,6% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figuur 6. Specifieke besmettelijkheid van de synthetische RNA getranscribeerd van een full-length JEV BAC en het herstel van de synthetische virus. BHK-21 cellen zijn mock-geëlektroporeerd (Mock) of geëlektroporeerd met de RNA-transcripten afgeleid frOM elk van de twee onafhankelijke klonen van de volledige lengte JEV BAC (Cl.1 en Cl.2). (A) RNA infectiviteit. De cellen bedekt met agarose en gekleurd met kristalviolet in 4 dagen na transfectie. RNA infectiviteit wordt bepaald door infectieuze midden assays voor de hoeveelheid infectieus RNA geëlektroporeerd in cellen (linker paneel) te schatten. Ook representatieve beelden van besmettelijke centra worden weergegeven (rechter paneel). (B) Eiwitexpressie. De cellen worden gekweekt in 4 putjes objectglaasjes kamer. Virale eiwitexpressie in RNA-geëlektroporeerde cellen op 20 uur na transfectie (HPT) wordt geanalyseerd door immunofluorescentie assays Een primair anti-NS1 konijnen antiserum en een secundair Cy3-geconjugeerd geiten anti-konijnen IgG (rood). De kernen worden tegengekleurd met 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (blauw). De immunofluorescentie beelden worden bedekt op de bijbehorende differentiële interferentie contrast beelden. (C) virusopbrengst. De cellen worden gekweekt in 150 mm cultuur gerechten. De productie van infectueuze virionen opgebouwd in de kweeksupernatanten van RNA-geëlektroporeerde cellen op 22 en 40 HPT wordt onderzocht door plaque assays. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik &#39;Single Virus Genomics&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Tot oprichting van een Liquid bedekte cultuur van gepolariseerde menselijke luchtwegen Epiteel Calu-3 cellen aan Host Cell Reactie op respiratoire pathogenen Studie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Elektroporatie van functionele bacteriële effectoren in zoogdiercellen

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...