Name: bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.

The authors have declared that they have no competing financial interests.

Den nåværende protokoll har blitt brukt til å generere full-lengde cDNA-kloner for infeksiøse to forskjellige stammer (CNU / LP2 27 og SA 14 28 -14-2) av JEV, en flavivirus som funksjonell cDNA har vist seg å være iboende vanskelig å konstruere og forplante grunn av vertscellen toksisitet og genetisk ustabilitet i klonet cDNA 8,74-76 Denne protokollen omfatter tre hovedkomponenter:. første, maksimere syntese / forsterkning av en trofast cDNA kopi av viral RNA ved hjelp av high-fidelity reverstranskriptase / DNA polymerase; andre, kloning av virale PRM-E-kodende region inneholder giftige sekvenser (upubliserte data) 74,77,78 i et meget lavt kopitall vektor BAC fra den første cDNA subkloning til de endelige full-lengde cDNA monteringstrinn; og tredje, utnytte en kloningsvektor BAC som kan huse en fremmed DNA med en gjennomsnittlig størrelse på 120-350 kb, 19-21 som tilsynelatende tåler større DNA inserts enn andre Kloningsvektorene. Denne kloning tilnærming vil være generelt anvendelig for mange andre positive-strand RNA-virus, spesielt de med et stort RNA genomet til ~ 10 til 32 kb. Generering av en smittsom cDNA-klonen er et viktig skritt i utviklingen av en omvendt genetikk system for RNA-virus, spesielt for positive-strand RNA-virus, fordi dens genom fungerer som viral mRNA som er oversatt til proteiner av vertscelle ribosomer. Således kan viral replikasjon initieres ved innføring av en cDNA-avledet genom-lengde RNA-molekyl inn i en vertscelle utsatt. Tilgjengeligheten av en smittsom JEV cDNA klone, når det kombineres med rekombinant DNA-teknologi, har økt vår forståelse av ulike aspekter av viral livssyklus på molekylært nivå, for eksempel genuttrykk 73,79 og genom replikering. 63,64 Også en full-lengde cDNA-klon JEV har vist seg å være et verdifullt verktøy for utviklingen av antivirale vaksiner 28 og genavleveringspartikler vektorer. &lt;sup&gt; 80,81 Som med alle positive-tråd RNA-virus, det er flere kritiske trinn i å konstruere et funksjonelt pålitelig cDNA for JEV hvorfra sterkt smittsomme RNA kan syntetiseres in vitro. Ideelt sett bør rekkefølgen av de syntetiske RNA transkribert fra en klon av full-lengde cDNA er identisk med den i det virale genomiske RNA, særlig de 5&#39;- og 3&#39;-terminale sekvenser som er nødvendige for initiering av RNA-replikasjon viral . 60-62 i den aktuelle protokoll, det autentiske 5&#39;- og 3&#39;-endene ble sikret ved å plassere SP6 promoter-sekvensen oppstrøms for det første adenin nukleotid av virusgenomet, og posisjonering av en unik kunstig Xba I restriksjonssete nedstrøms for den siste tymin nukleotid av virusgenomet, respektivt. Avkortet syntetiske RNA med autentisk 5 &#39;og 3&#39; ender ble produsert av run-off transkribering av et Xba I-linearisert og MBN-behandlede cDNA template ved hjelp av SP6 RNA-polymerase grunnes med 7 G m (5 &#39;) ppp (5&#39;) A cap-analog. Denne protokollen kan modifiseres på flere måter. For in vitro transkripsjon, kan en annen bakteriofag RNA-polymerase (f.eks, T3 og T7) brukes i forbindelse med den veldefinerte promotorsekvens. 27 Som et run-off område, kan et annet restriksjonssete benyttes hvis det ikke er til stede i det virale genom, og hvis syntetisk RNA fra den lineariserte cDNA ender med autentisk 3 &#39;ende. Betydningen av 3&#39;-enden nukleotidsekvens er blitt demonstrert ved en ~ 10-gangers reduksjon i RNA-smittsomhet ved en syntetisk RNA inneholder tre eller fire virus urelatert nukleotider ved sin 3 &#39;ende. 27 I en in vitro-transkripsjonsreaksjon, både m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A og m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G cap analog kan anvendes like godt, selv om de sistnevnte steder et ubeslektet ekstra G nukleotid oppstrøms for viral 5 &#39;-end, mentillegg endrer ikke smittsomhet eller replikasjonen av syntetisk RNA. 27 Dessuten er det ikke nødvendig for RNA smittsomhet tester fjerning av cDNA templat fra RNA-transkripter av DNase I-fordøyelse, fordi cDNA templat i seg selv ikke er smittsomme. 27 BAC teknologi har nå blitt brukt til å bygge smittsomme cDNA kloner for en håndfull av positiv leder RNA-virus, nemlig to JEVs, CNU / LP2 27 og SA 14 -14-2 28 (genomstørrelse, ~ 11 kb); to dengue virus, BR / 90 26 og NGC 29 (~ 11 kb); storfe viral diaré virus, SD1 (~ 12 kb), 25 to-klassisk svinepest virus, C og Paderborn (~ 12 kb), 24 grensen disease virus, Gifhorn (~ 12 kb), 24 på svin og respiratorisk syndrom virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 den overfør gastroenteritt virus, PUR46-MAD (~ 29 kb), 16 feline smittsom bukhinnebetennelse virus,DF-2 (~ 29 kb); 32 den Sars coronavirus, Urbani (~ 30 kb), 9 Midtøsten respiratorisk syndrom coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), 17 og den menneskelige coronavirus, OC43 (~ 31 kb) 31. Den største fordelen med å bruke BACS for cDNA konstruksjon er høy genetisk stabilitet av de store, 1- eller 2-kopi BAC plasmider.; imidlertid den iboende natur av dens ekstremt lave kopitall også en stor ulempe, på grunn av meget lave utbytter av BAC-DNA og den derav følgende reduksjon i renheten av BAC-DNA i forhold til vertens kromosomale DNA. I dagens protokollen, er utbyttet av BAC DNA maksimert ved å dyrke E. coli DH10B transformert med den smittsomme BAC pBAC / SA 14 -14-2 i et næringsrikt medium, 2xYT. Til tross for dette arbeidet, er bare ~ 15 mikrogram av BAC DNA fra 500 ml 2xYT buljong gjennomsnittlig yield. Dessuten er renheten av BAC DNA best oppnås ved hjelp av CsCl-EtBr tetthetsgradient-sentrifugering for rensing, Snarere enn den som vanligvis brukes kolonne-basert plasmid isolert. Det er imidlertid viktig å huske på at BAC-transformert E. coli bør ikke overgrow fordi det kan true den genetiske stabiliteten i klonet cDNA, og høyere vekst ikke nødvendigvis føre til større avlinger eller høyere renhet BAC DNA. Protokollen er beskrevet her er en optimalisert, effektiv og strømlinjeformet fremgangsmåte for bygging og forplantning av en genetisk stabil full-lengde cDNA-klon som smittende en BAC til JEV, en fremgangsmåte gang trodde praktisk talt umulig. Denne samme kloningsstrategien kan også anvendes til mange andre positive kjedede RNA-virus. Generelt smittsomme cDNA kloner gjør oss i stand til å innføre en rekke mutasjoner (f.eks slettinger, innsett og punktmutasjoner) inn i en viral RNA genom for å studere deres biologiske funksjoner i virusreplikasjon og patogenese. Dette cDNA-basert revers genetikk system gjør det mulig å utvikle og test vaksine og terapeutiske kandidater rettet mot en virulens faktor (er) av en bestemt positiv tråd-RNA-virus er av interesse. I tillegg kan denne infiserende cDNA teknologien også benyttes som en viral vektor som er i stand til å uttrykke et fremmed gen (er) av interesse i mange anvendelser innen biomedisinsk forskning.

For RNA virologists, ankomsten av rekombinant DNA-teknologi på slutten av 1970-tallet har gjort det mulig å omdanne virale RNA-genomer inn i cDNA-kloner, som deretter føres videre som plasmider i bakterier for genetisk manipulering av RNA-virus. 1. Den første RNA-virus å være molekylært klonet ble bakteriofag Qp, en positiv tråd-RNA-virus som infiserer Escherichia coli. Et plasmid inneholdende en komplett cDNA-kopi av det genomiske RNA Qg ga opphav til infeksjons Qp-fag når det innføres i E. coli. 2 Kort tid deretter ble denne teknikken brukt til poliovirus, en positiv tråd-RNA-virus hos mennesker og dyr. Et plasmid som bærer en full-lengde cDNA av poliovirus genomisk RNA er infeksiøs når transfektert inn i pattedyrceller og er i stand til å produsere infeksiøse virioner 3 I denne &quot;DNA-lanserte&quot; tilnærming, bør de klonede cDNA&#39;ene bli transkribert intracellulært å initiere viral RNA-replikasjon.;Imidlertid er det uklart hvordan den transkripsjon initieres og hvor transkriptene blir behandlet på riktig viral sekvens. Denne bekymringen har ført til utvikling av en alternativ &quot;RNA-innføring av&quot; metode, hvorved en fullstendig cDNA-kopi av det virale RNA-genom er klonet under en promoter gjenkjennes av en E. coli eller fag RNA polymerase for produksjon av syntetiske RNA in vitro med definert 5 &#39;og 3&#39; termini, som er gjenstand for den fullstendige virale replikasjonssyklus når introdusert inn i vertsceller. 4,5 Den første Suksessen med denne fremgangsmåten ble rapportert for brome mosaikkvirus , 6,7 en positiv tråd-RNA-virus av planter. Siden den gang har RNA-lansert tilnærming er utviklet for et bredt spekter av positive leder RNA-virus, inkludert caliciviruses, alfavirus, flavivirus, arteriviruses og coronavirus. 1,4,5,8 I både DNA- og RNA-lansert revers genetikk systemer, bygging av en full-lengde cDNA-klon er nøkkelen til å danne infeksjons DNA eller RNA av positiv-kjedede RNA-virus, men det blir et betydelig teknisk utfordring som størrelsen av virusgenomet øker. 9-17 særlig et stort RNA-genom på ~ 10 -32 kb presenterer tre største hindringer for kloning av en full-lengde cDNA-funksjonell. 18 Den første vanskelighet er syntesen av en trofast cDNA kopier, fordi nøyaktigheten av RT-PCR er omvendt proporsjonal med lengden av det virale RNA. Den andre hinderet er nærværet av potensielt toksiske sekvenser, ettersom lange RNA-molekyler er mer sannsynlig å inneholde uventede sekvenser i stand til å lage cDNA-fragmentet i plasmidene ustabile i E. coli. Den tredje og mest viktige er tilgjengeligheten av en egnet vektor, siden det er vanskelig å finne en kloningsvektor som kan huse et viralt cDNA-innskudd på&gt; 10 kb. I løpet av de siste tre tiårene, har disse barrierene blitt overvunnet av flere fremskritt i enzymologi, metodikk, end vectorology. 1,4,5,8 Av disse er de mest lovende og innovativ utvikling kloning av store positive leder RNA-virus som smittsomme bakterie kunstige kromosomer (Bacs). BAC-vektor er en lav-kopi kloning plasmid (1-2 kopier / celle) basert på E. coli fruktbarhet faktor, med en gjennomsnittlig størrelse på DNA-innskuddet ~ 120-350 19-21 kb DNA-fragment settes inn i BAC-vektor i en lignende måte til kloning inn generelle kloningsvektorer.; de resulterende klonene BAC er stabile over flere generasjoner i E. coli. 22,23 Hittil har BAC teknologien blitt brukt til å lage smittsomme cDNA kloner for&gt; 10 medlemmer av tre positive leder RNA virus familier, dvs. Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 og Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32 Ved hjelp av japansk encefalitt virus (JEV) som et eksempel, rapporterer dette arbeidet de detaljerte prosedyrer som kan værebrukes til å konstruere et genetisk stabil full-lengde smittende BAC for en rekke positive kjedede RNA-virus. JEV er en zoonotisk flavivirus 33 som overføres i naturen mellom fugler, griser og andre virveldyr verter ved mygg vektorer. 34,35 Hos mennesker kan JEV infeksjon føre til alvorlig ofte dødelig nevrologisk sykdom japansk encefalitt (JE), 36 som forekommer i Asia og deler av det vestlige Stillehavet, 37,38 med en estimert årlig forekomst av ~ 50,000-175,000 kliniske tilfeller. 39,40 Genomet av JEV er en ~ 11 kb, enkeltrådet, positive-sense RNA-molekylet, og består av en enkelt åpen leseramme (ORF) flankert av to ikke-kodende regioner (NCR) ved 5 &#39;og 3&#39; ender. 41,42 ORF koder for et polyprotein som blir spaltet av verts og virale proteaser for å generere 10 individuelle proteiner, betegnet C, PRM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, og NS5 i N- til C-terminal retning. 34,43,44 Også en eXtended form av NS1 (NS1 &#39;) uttrykkes med -1 ribosomal frameshifting i kodon 8-9 av NS2A. 45,46 Av disse 11 proteiner, de tre strukturelle proteiner (C, PRM, og E) er viktig for dannelsen av smittsomme virioner, 47,48 og de ​​resterende åtte ikke-strukturelle proteiner (NS1 til NS5, og NS1 &#39;) er avgjørende for viral RNA-replikasjon, 49-51 partikkel montering, 52-56 og medfødt immunitet flukt. 57-59 både 5&#39; og 3 &#39;NCR inneholder konservert primære sekvenser og skjema RNA sekundære / tertiære strukturer, 60-62 som er viktige for å modulere viral RNA replikasjon. 63,64 Denne protokollen beskriver verktøy, metoder og strategier for å generere en full-lengde smittende BAC av JEV SA 14 -14-2. 28 Dette funksjonelle BAC klone inneholder en komplett cDNA kopi av JEV genomisk RNA, 65 som er omfattet av en promoter for SP6 RNA polymerase oppstrømsav viral 5&#39;-enden og et unikt Xbal restriksjonssete nedstrøms for viral 3&#39;-enden for in vitro transkripsjon avrenning. Dette BAC teknologien kan anvendes til å konstruere en fullstendig funksjonell cDNA molekylær klon for en rekke positive kjedede RNA-virus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">1. Molecular Cloning</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2xYT Broth</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">Y2377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">[3H]UTP</td>
			<td style="width:275px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:243px;">NET380250UC</td>
			<td>Radioactive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">50-mL Tube</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific (Nalgene)</td>
			<td style="width:243px;">3114-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">250-mL Bottle</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:243px;">50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose (Low Melting Point)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvaI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0152S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvrII</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0174S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BamHI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsiWI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsrGI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Butanol</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">A399-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cap Analog [m7G(5&#697;)ppp(5&#697;)A]</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">S1405S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">BP1595-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloroform</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C2432</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">DE-81 Filter Paper</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">3658-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18427-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">E. coli DH10B&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18297-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">EDTA</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7637</td>
			<td>Toxic and highly mutagenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">A6283</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Roche</td>
			<td style="width:243px;">10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">I9392</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0918</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">LB Broth</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lithium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Mung Bean Nuclease</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Needle (18G, 20G)</td>
			<td style="width:275px;">BD</td>
			<td style="width:243px;">305196, 305175</td>
			<td>Biohazardous (Sharps waste)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">NotI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Oligonucleotide</td>
			<td style="width:275px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:243px;">Custom Oligonucleotide Synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">PacI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">pBeloBAC11</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol (Buffer-Saturated)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15513-039</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15593-031</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Guanidine Isothiocyanate</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Ambion)</td>
			<td style="width:243px;">10296-010</td>
			<td>Toxic, corrosive, and irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Pme I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">rNTP Set</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">27-2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sealable Polypropylene Tube (16 &#215; 76 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">342413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SfiI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0123S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sma I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SP6 RNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0207S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Spin Column (Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Syringe</td>
			<td style="width:275px;">HSW NORM-JECT</td>
			<td style="width:243px;">4200.000V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tris</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">tRNA (yeast)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">XbaI&#160;</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2. Cell Culture</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Alpha Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">12561-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Conical Tube (50 mL)</td>
			<td style="width:275px;">VWR</td>
			<td style="width:243px;">21008-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Crystal Violet&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Culture Dish (150 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">93150&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cuvette (2-mm Gap)</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">450125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">F1635</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">61100-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Six-Well Plate</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vitamins</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:275px;">Mupid</td>
			<td style="width:243px;">MPDEXU-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">Heracell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Desktop Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Electroporator</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td>
			<td style="width:275px;">UVP</td>
			<td style="width:243px;">UVGL-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">368826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:243px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vortexer</td>
			<td style="width:275px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:243px;">G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Water Bath</td>
			<td style="width:275px;">Jeio Tech</td>
			<td style="width:243px;">WB-10E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

For alle positive-tråd RNA-virus, påliteligheten og effektiviteten til en revers genetikk-system avhenger av den genetiske stabiliteten til et klonet full-lengde cDNA, hvis sekvens er ekvivalent med konsensussekvensen av viralt genomisk RNA. 27 Figur 1 viser en fem- trinns strategi for bygging av en full-lengde smittende cDNA som en BAC for JEV SA 14 -14-2 28: Trinn 1, rensing av viral RNA fra cellekultursupernatanten av JEV-infiserte BHK-21 celler (Figur 1a); Trinn 2, syntese av fire overlapp cDNA amplikonene (F1 til F4) spenner over hele viral genom (figur 1B); Trinn 3, subkloning av hver av de fire sammenhengende cDNA-fragmenter inn i en BAC-vektor, som skaper pBAC / F1 til pBAC / F4 (figur 1C); Trinn 4, endring av klonede cDNAs for in vitro avrenning transkripsjon med SP6 RNA polymerase, dvs. plassere en SP6promotorsekvens umiddelbart oppstrøms for viral 5&#39;-enden (pBAC / F1 SP6), å eliminere en pre-eksisterende interne Xba I setet ved nukleotid 9131 ved å innføre en punktmutasjon stille, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), og innsetting en ny kunstig Xbal run-off-sete umiddelbart nedstrøms for viral 3&#39;-enden (pBAC / F4 RO) (figur 1D); og trinn 5, montering av en full-lengde SA 14 -14 til 2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (figur 1E). Tabell 1 viser oligonukleotider som brukes i denne kloning prosedyren. 28 For bygging av en funksjonell JEV cDNA, er det første viktige trinnet ved syntesen av de fire overlappende cDNA-fragmenter ved hjelp av den rensede virus-RNA som et templat for RT-PCR. Figur 2 gir et representativt resultat for de fire RT-PCR-produkter som var underkastet elektroforese på en 0,8%agarose gel. Denne gel viser tydelig at en full-lengde JEV cDNA forsterkes i fire overlapp cDNA fragmenter. Av og til kan RT-PCR-reaksjoner gi en eller flere ytterligere virus-spesifikke eller ikke-spesifikke produkter som er hovedsakelig mindre enn det forventede produkt, på grunn av den ikke-spesifikke annealing av primerne i løpet av cDNA-syntese / forsterkning. På den annen side er liten eller ingen forventede RT-PCR-produkt ville bli forsterket på grunn av utilsiktet RNase forurensning under det virale RNA isolering eller feilfunksjon i RT-PCR. Den neste viktige trinn er kloning og modifikasjon av en partial- eller full-lengde cDNA JEV i BAC, som er en relativt enkel fremgangsmåte som bruker standard rekombinante DNA-teknikker. 69 Figur 3 viser et representativt resultat for rensing av BAC-klon innehold en full-lengde cDNA av JEV SA 14 -14 til 2 av banding i en CsCl-EtBr gradient.I dette eksperimentet ble, etter sentrifugering i 16 timer ved 401 700 x g, to distinkte bånd, dvs. E. coli-kromosomalt DNA ovenfor, og supercoil BAC plasmid DNA nedenfor, er synlig i midten av røret ved langbølget ultrafiolett lys. Et minimalt volum (~ 400 ul) av den nedre BAC DNA bånd ble omhyggelig samlet opp ved å stikke et hull med en sprøyte på siden av røret. Deretter ble EtBr ekstrahert fra BAC-DNA ved hjelp av butanol ekstraksjon, og EtBr-frie BAC DNA ble konsentrert ved etanolutfelling. Det siste trinnet er å bestemme den spesifikke smittsomhet av de syntetiske RNA transkribert in vitro fra full-lengde SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) etter at RNA-transfeksjon inn i permissive celler (figur 4). Dette trinnet omfatter tre sekvensielle trinn: Trinn 1, linearisering av fullengde SA 14 -14-2 cDNA ved 3&#39;--enden av det virale genom (figur 4A); Trinn 2, produksjon av syntetiske RNA fra linearized cDNA ved avrenning transkripsjon (4B); og trinn 3, redning av de rekombinante virus i BHK-21-celler transfektert med de syntetiske RNA (Figur 4C). Eksperimentelt, ble to uavhengige kloner av pBAC / SA 14 -14-2 linearisert med Xbal fordøyelse og behandlet med MBN å fjerne fire-base-5 &#39;overhenget som genereres av Xbal fordøyelsen. De lineariserte BACS ble ryddet av fenol-kloroform ekstraksjon, etterfulgt av etanol nedbør. Linearisering av de to rensede BACS ble demonstrert på en 0,8% agarose-gel (figur 5A). Fenol-kloroform-ekstraksjon må gjøres forsiktig for å sikre at de lineariserte BACS er RNase-fri. Hver av de to lineariserte BACS tjente som et templat for cDNA avviklings transkripsjon ved hjelp av SP6 RNA-polymerase i nærvær av 7 G m (5 &#39;) ppp (5&#39;) En hette analog. Integriteten av de syntetiske RNA ble vist ved å kjøre prøver av de to transkripsjonsreaksjonsblandinger på en 0,6% agarose-gel, sammen med et referanse 1 kb DNA-stige (figur 5B). I dette enkle analysen, som utgjør hoved fremtredende RNA bånd alltid overført bare under 3 kb referere DNA band og så ut til å være skarp. Imidlertid nedbrytes RNA ville ha en utflytende utseende på den samme gel. En smittsom sentrum analysen er gullstandarden for å fastsette den konkrete smittsomhet av de syntetiske RNA. Denne analysen ble gjort ved electroporating BHK-21-celler med RNA prøver, såing like store porsjoner av 10-ganger seriefortynnet elektroporerte celler i 6-brønners plater inneholdende naive BHK-21-celler (3 x 10 5 celler / brønn), og overliggende agarose på cellemonolagene. Etter inkubering i 4 dager ble overlevende celler fiksert med formaldehyd og farget med et krystallfiolett solution å kvantifisere antallet av infeksjonssentre (plaques), som svarer til antallet smittsomme RNA-molekyler som leveres inn i celler (figur 6A). Siden cDNA-mal som brukes for in vitro transkripsjon har vist seg å være ikke-infeksiøst, ble 27 en prøve av transkripsjonsreaksjonsblanding anvendes direkte for elektroporering. Elektroporering er den foretrukne metode for RNA-transfeksjon; Alternativt kan RNA bli transfektert ved andre fremgangsmåter ved bruk av DEAE-dekstran og kationiske liposomer. RNA elektroporasjon er meget effektiv, men &quot;overslag&quot; av den elektriske puls opptrer sjelden, hvis salter er til stede i electroporation reaksjonen eller hvis elektroporeringskyvette anvendes på nytt. Ekspresjon av virusproteiner i RNA-transfekterte celler ble undersøkt ved immunfluorescens analyser ved anvendelse av et anti-NS1 kanin-antiserum (figur 6B). Produksjon av viruspartikler akkumulert i supernatantene av RNA-transfekterte celler var enalyzed av plakk analyser (figur 6C). Resultatene fra disse forsøk viser klart at cDNA-avledede syntetiske RNA er infeksiøs i permissive BHK-21-celler, å generere en høy titer av rekombinante virus. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonukleotid </td><td> En sekvens (5 &#39;til 3&#39;) </td><td> Posisjon b </td><td> Polaritet </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td> Sans </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> Maurisense </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Sans </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Sans </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10952-10977 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Sans </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956 til 10977 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac TA </td><td></td><td> Sans </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Sans </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Sans </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Sans </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10670-10694 </td><td> Sans </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10954-10977 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td colspan="4"> en JEV sekvensene vises i store bokstaver, og BAC sekvenser er angitt i små bokstaver. b nukleotidposisjon refererer til hele genomsekvens av JEV SA 14 -14-2 (Genbank tiltredelse antall JN604986). </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Oligonukleotider anvendt for cDNA-syntese, PCR-amplifikasjon, og BAC mutagenese. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figur 1.0; Strategi for bygging av en full-lengde cDNA av JEV SA 14 -14-2 som en BAC (A) Isolering av viral RNA fra JEV partikler.. Det er vist et skjematisk diagram av det genomiske RNA til JEV SA 14 -14-2. (B) Syntese av fire overlappende cDNA-fragmenter (F1 til F4) som dekker hele virale genom. (C) Subkloning av fire overlapp cDNA fragmenter inn i en BAC vektor, skape pBAC / F1 til pBAC / F4. (D) Modifisering av de klonede cDNAs for avrenning transkripsjon in vitro. pBAC / F1 SP6 er et derivat av pBAC / F1 som inneholder SP6 promoter-sekvensen oppstrøms for viral 5&#39;-enden. pBAC / F3 KO er et derivat av pBAC / F3 som inneholder en stille punktmutasjon (A 9134 → T, stjerne). pBAC / F4 RO er et derivat av pBAC / F4 som inneholder en kunstig Xbal run-off-setet nedstrøms for den virale 3&#39;-enden. (E </<html> strong&gt;) Montering av en full-lengde SA 14 -14 til 2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Figur 2. Syntese av fire overlapp cDNA fragmenter (F1 til F4) spenner over full-lengde genomisk RNA av JEV SA 14 -14-2. De fire RT-PCR-produktene evalueres ved elektroforese i en 0,8% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. De forventede størrelser av de fire cDNA fragmenter er indikert på bunnen av gelen bildet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3. Rensing av BAC inneholder en full-lengde cDNA av JEV SA 14 -14-2. Er BAC plasmid isolert fra E. coli DH10B ved SDS-alkaliske lyseringsmetode og ytterligere renset ved hjelp av striper på en CsCl-EtBr gradient. Presenteres er et eksempel på CsCl-EtBr gradient ved hjelp av en 16 × 76 mm forseglbart polypropylen rør. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Figur 4. Oversikt over utvinning av infeksiøse virus fra en full-lengde JEV SA 14 -14-2 cDNA satt sammen i en BAC. (A) Linearisering av cDNA templat. The full-lengde JEV BAC er kuttet medXbal og behandlet med MBN. (B) Syntese av RNA-transkripter. Det lineariserte cDNA transkribert ved SP6-RNA-polymerase i nærvær av 7 G m (5 &#39;) ppp (5&#39;) A cap-analog. (C) Gjenoppretting av syntetisk JEVs. In vitro transkriberte RNA transfektert inn BHK-21 celler ved elektroporering, som genererer en høy titer av syntetisk virus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figur 5. Syntese av RNA ved in vitro transkripsjon ved hjelp av en full-lengde JEV BAC som et cDNA mal. (A) Generering av det lineariserte helaftens JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. To uavhengige kloner av pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 og Cl.2) blir linearisert ved spaltning med Xbal og påfølgende behandling med MBN. De lineariserte BACS blir undersøkt ved hjelp av elektroforese på en 0,8% agarosegel. (B) Produksjon av syntetiske RNA ved avrenning transkripsjon. Hver av de to lineariserte BACS brukes som en mal for SP6 RNA polymerase avrenning transkripsjon. Alikvoter av de to transkripsjonsreaksjoner blir kjørt på en 0,6% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figur 6. Spesifikk smittsomhet av de syntetiske RNA transkribert fra en full-lengde JEV BAC og utvinning av syntetisk virus. BHK-21 celler er mock-elektroporert (Mock) eller elektroporert med RNA transkripsjoner avledet from hver av de to uavhengige kloner av full lengde JEV BAC (Cl.1 og Cl.2). (A) RNA smittsomhet. Cellene ble belagt med agarose og farget med krystallfiolett i 4 dager etter transfeksjon. RNA infektivitet er bestemt av smittsomme midt assays for å estimere mengden av infeksiøs RNA elektroporert inn i de celler (venstre panel). Dessuten er representative bilder av smittsomme sentre vist (høyre panel). (B) Protein ekspresjon. Cellene blir dyrket i 4-brønners kammerobjektglass. Viralt protein ekspresjon i RNA-elektroporert celler ved 20 timer etter transfeksjon (HPT) analyseres ved hjelp av immunofluorescens-analyser ved anvendelse av et primært anti-kanin-antiserum NS1 og en sekundær Cy3-konjugert geit-anti-kanin-IgG (rød). Kjernene er kontrafarget med 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindol (blå). De immunfluorescens bildene kledde på sine tilsvarende differensial bilder kontrast forstyrrelser. (C) Virus yield. Cellene blir dyrket i ett50 mm kultur retter. Produksjonen av smittsomme viruspartikler akkumulert i kultursupernatantene av RNA-elektroporert celler på 22 og 40 HPT er undersøkt av plakk analyser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakteriell kunstige kromosomer: En funksjonell genom Tool for studier av Positive-strand RNA virus

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Isolasjon og Genome Analysis of single Virioner bruker &#39;enkelt virus Genomics&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering av en flytende dekket Culture of Polarized Menneskelig Airway Epiteliale Calu-3 Cells å studere Host Cell Response til luftveispatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk manipulering i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammer for Funksjonell genom analyse av<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Etter i Real Time Impact of Pneumokokk virulens faktorer i en akutt Mouse Lungebetennelse Modell Bruke Bioluminescent Bakterier

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Oppdager Glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodisk Acid Schiff Farging

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Electroporation av Funksjonelle Bakterielle Effektor i pattedyrceller

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administrering av rekombinant influensavaksiner i Chimerisk musemodeller for å studere slimhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...