Name: bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.

The authors have declared that they have no competing financial interests.

El protocolo actual ha sido utilizado con éxito para generar de larga duración clones de cDNA infecciosos para dos cepas diferentes (CNU / LP2 27 y SA 14 -14-2 28) de JEV, un flavivirus cuyo cDNA funcional ha demostrado ser inherentemente difícil de construir y propagar debido a la toxicidad de la célula huésped y la inestabilidad genética del cDNA clonado 8,74-76 Este protocolo implica tres componentes principales:. primeros, maximizando la síntesis / amplificación de una copia de ADNc fieles de la ARN viral de alta fidelidad utilizando transcriptasa inversa / ADN polimerasa; segundo, la clonación de la región viral prM-E de codificación que contiene secuencias tóxicas (datos no publicados) 74,77,78 en un muy bajo número de copias del vector BAC a partir del ADNc inicial subclonación a las de longitud completa pasos finales de montaje cDNA; y tercero, la utilización de un BAC vector de clonación que puede acomodar un ADN extraño con un tamaño medio de 120 a 350 kb, 19-21 que aparentemente tolera más grande inse DNArts que hacen otros vectores de clonación. Este enfoque de clonación será generalmente aplicable a muchos otros virus de ARN de cadena positiva, particularmente aquellos con un gran genoma de ARN de ~ 10 a 32 kb. Generación de un clon de cDNA infeccioso es un paso clave en el desarrollo de un sistema de genética inversa para los virus de ARN, especialmente para los virus de ARN de cadena positiva, porque su genoma actúa como ARNm viral que se traduce en proteínas por los ribosomas de la célula huésped. Por lo tanto, la replicación viral puede ser iniciado por la introducción de un genoma de ARN de longitud molécula de ADNc derivado en una célula huésped susceptible. La disponibilidad de un clon de ADNc infeccioso JEV, cuando se combina con la tecnología de ADN recombinante, se ha incrementado nuestra comprensión de los diversos aspectos del ciclo de vida viral a nivel molecular, tales como la expresión génica y la replicación del genoma 73,79. 63,64 Además, una ADNc de longitud completa JEV clon ha demostrado ser una herramienta valiosa para el desarrollo de vacunas antivirales 28 y vectores de suministro de genes. &lt;sup&gt; 80,81 Al igual que con todos los virus de ARN de cadena positiva, hay múltiples pasos críticos en la construcción de un ADNc funcional confiable para JEV partir de la cual RNAs altamente infecciosas se pueden sintetizar in vitro. Idealmente, la secuencia de los ARN sintéticos transcritos a partir de un clon del ADNc de longitud completa debe ser idéntica a la del ARN genómico viral, en particular los 5&#39;-y 3&#39;-terminales secuencias que se requieren para la iniciación de la replicación viral RNA . de 60-62 En el protocolo actual, el auténtico 5&#39;-y 3&#39;-extremos se aseguraron mediante la colocación de la secuencia del promotor SP6 aguas arriba de la primera de nucleótidos de adenina del genoma viral y el posicionamiento de un sitio artificial única restricción Xba I aguas abajo de la última timina nucleótidos del genoma viral, respectivamente. Capsulado RNAs sintéticos con el auténtico 5 &#39;y 3&#39; se produjeron mediante transcripción run-off de un cDNA te Xba I-linealizado y tratado con MBNmplate usando SP6 ARN polimerasa cebada con la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un análogo de tapa. Este protocolo puede ser modificado de varias maneras. Para la transcripción in vitro, otro ARN del bacteriófago polimerasa (por ejemplo, T3 o T7) se puede utilizar en conjunción con su secuencia promotora bien definido. 27 Como un sitio run-off, un sitio de restricción diferente se puede utilizar si no está presente en el genoma viral y si ARN sintético a partir del ADNc linealizado termina con el final auténtico 3 &#39;. La importancia de la secuencia de nucleótidos del extremo 3 &#39;se ha demostrado por una disminución de ~ 10 veces en la infectividad del ARN cuando un ARN sintético contiene tres o cuatro nucleótidos-virus no relacionado en su extremo 3&#39;. 27 En una reacción de transcripción in vitro, tanto la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A y m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G analógico tapa puede ser utilizado igualmente bien, aunque los últimos lugares una relación G nucleótidos extra de aguas arriba de la viral 5 &#39;-end, pero queAdemás no altera la infectividad o replicación del ARN sintético. 27 Por otra parte, la eliminación de la plantilla de ADNc a partir de los transcritos de ARN por digestión con DNasa I no es necesario para las pruebas de ARN de infectividad, porque la plantilla de cDNA en sí no es infecciosa. 27 La tecnología BAC ahora se ha aplicado a la construcción de clones de cDNA infecciosos para un puñado de virus de ARN de cadena positiva, a saber, dos JEVs, CNU / LP2 27 y SA 14 -14-2 28 (tamaño del genoma, ~ 11 kb); dos virus del dengue, BR / 90 26 y NGC 29 (~ 11 kb); la diarrea viral bovina virus, SD1 (~ 12 kb); 25 de dos virus de la peste porcina clásica, C y Paderborn (~ 12 kb); 24 el virus de la enfermedad de fronteras, Gifhorn (~ 12 kb); 24 el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 el virus de la gastroenteritis transmisible, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 el virus de la peritonitis infecciosa felina,DF-2 (~ 29 kb); 32 el síndrome severo coronavirus respiratorio agudo, Urbani (~ 30 kb); 9 el síndrome respiratorio coronavirus Oriente Medio, EMC / 2012 (~ 30 kb); 17 y el coronavirus humano OC43 (~ 31 kb) 31 La principal ventaja de usar BAC para la construcción de ADNc es la alta estabilidad genética de los grandes, plásmidos BAC de 1 o 2 copias.; sin embargo, la naturaleza intrínseca de su número extremadamente bajo de copia es también una gran desventaja, debido a muy bajos rendimientos de ADN BAC y la consiguiente reducción en la pureza del ADN de BAC con respecto a la sede de ADN cromosómico. En el protocolo actual, el rendimiento de ADN de BAC se maximiza por el crecimiento de E. coli DH10B transformó con el pBAC BAC infeccioso / SA 14 -14-2 en un medio rico en nutrientes, 2xYT. A pesar de este esfuerzo, el rendimiento promedio es de sólo ~ 15 g de ADN BAC a partir de 500 ml de caldo 2xYT. Además, la pureza del ADN de BAC se logra mejor mediante el uso de CsCl-EtBr centrifugación en gradiente de densidad para la purificación, En lugar del plásmido aislamiento basado en columnas de uso común. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la E. BAC-transformado coli no debe crecer demasiado, ya que podría poner en peligro la estabilidad genética del cDNA clonado, y un mayor crecimiento no necesariamente conducir a mayores rendimientos o ADN BAC de mayor pureza. El protocolo descrito aquí es un optimizado, y el método aerodinámico eficiente para la construcción y propagación de una larga duración cDNA clon infeccioso genéticamente estable como un BAC de JEV, un procedimiento, una vez pensó prácticamente imposible. Esta misma estrategia de clonación se puede aplicar también a muchos otros virus de ARN de cadena positiva. En general, los clones de ADNc infecciosos nos permiten introducir una variedad de mutaciones (por ejemplo, deleciones, inserciones, y mutaciones puntuales) en un genoma de ARN viral para estudiar sus funciones biológicas en la replicación viral y la patogénesis. Este sistema de genética inversa basada en cDNA hace que sea posible desarrollar y TESt vacuna y candidatos terapéuticos dirigidos a un factor de virulencia (s) de un virus de ARN de cadena positiva particular de interés. Además, esta tecnología cDNA infeccioso también puede ser utilizado como un vector viral, capaz de expresar un gen extraño (s) de interés para muchas aplicaciones en la investigación biomédica.

Para virólogos de ARN, el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante a finales de 1970 hizo posible convertir genomas de ARN viral en los clones de ADNc, que luego podrían ser propagan como plásmidos en bacterias para la manipulación genética de los virus de ARN. 1 La primera virus de ARN para ser molecularmente clonado se Qß bacteriófago, un virus de ARN de cadena positiva que infecta a Escherichia coli. Un plásmido que contiene una copia completa de ADNc del ARN genómico Qß dio lugar a fagos Qß infecciosas cuando se introduce en E. coli. 2 Poco después, esta técnica se aplicó a poliovirus, un virus de ARN de cadena positiva de los seres humanos y animales. Un plásmido que lleva un ADNc de longitud completa del ARN genómico poliovirus se infecciosas cuando se transfecta en células de mamífero y capaz de producir viriones infecciosos 3 En este enfoque &quot;DNA-puesto en marcha&quot;, los ADNc clonados deben ser transcritas intracelularmente para iniciar la replicación del ARN viral.;Sin embargo, no está claro cómo se inicia la transcripción y cómo las transcripciones se procesan a la secuencia viral correcta. Esta preocupación ha llevado al desarrollo de un &quot;RNA-lanzado&quot; enfoque alternativo, en el que se clona una copia completa de ADNc del genoma de ARN viral bajo un promotor reconocido por una E. coli o ARN polimerasa del fago para la producción de RNAs sintéticos in vitro con definido 5 &#39;y 3&#39;, que se someten al ciclo de replicación viral completa cuando se introduce en células huésped. 4,5 El primer éxito con este enfoque se informó para el virus del mosaico del bromo 6,7, un virus de ARN de cadena positiva de las plantas. Desde entonces, el enfoque de ARN-lanzado ha sido desarrollado para una amplia gama de virus de ARN de cadena positiva, incluyendo calicivirus, flavivirus, alfavirus, arterivirus y coronavirus. 1,4,5,8 Tanto en el ADN y ARN-lanzado sistemas de genética inversa, la construcción de un full de longitud clon de ADNc es la clave para la generación de ADN o ARN infecciosa de los virus de ARN de cadena positiva, pero se convierte en un considerable reto técnico como el tamaño de los aumentos del genoma viral. 9-17 En particular, un gran genoma de ARN de ~ 10 -32 kb presenta tres principales obstáculos para la clonación de un ADNc funcional de cuerpo entero. 18 La primera dificultad es la síntesis de una fiel copia de ADNc, ya que la fidelidad de RT-PCR es inversamente proporcional a la longitud del ARN viral. El segundo obstáculo es la presencia de secuencias potencialmente tóxicos, ya que las moléculas de ARN largas son más propensas a contener secuencias inesperadas capaces de hacer que el fragmento de ADNc en los plásmidos inestables en E. coli. La tercera y más importante problema es la disponibilidad de un vector adecuado, ya que es difícil encontrar un vector de clonación que puede albergar un inserto de ADNc viral de&gt; 10 kb. Durante las últimas tres décadas, estas barreras han sido superadas por varios avances en enzimología, la metodología, un. d vectorología 1,4,5,8 De éstos, el desarrollo más prometedor e innovador es la clonación de grandes virus de ARN de cadena positiva cromosomas artificiales bacterianos (BAC como infecciosas). El vector de BAC es un plásmido de bajo copia clonación (1-2 copias / célula) basado en el E. factor de fertilidad coli, con un tamaño medio de inserto de ADN de ~ 120-350 kb 19 a 21 Un fragmento de ADN se inserta en el vector de BAC en una manera similar a la clonación en vectores de clonación generales.; los clones BAC resultantes son estables a lo largo de muchas generaciones en E. . coli 22,23 Hasta la fecha, la tecnología BAC se ha utilizado para crear clones de cDNA infecciosos para&gt; 10 miembros de tres familias de virus de ARN de cadena positiva, es decir, Flaviviridae, 24-29 de Arteriviridae, 30 y Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32 El uso de virus de la encefalitis japonesa (JEV) como ejemplo, el presente trabajo presenta los procedimientos detallados que pueden serutilizado para construir un integral BAC infeccioso genéticamente estable para una variedad de virus de ARN de cadena positiva. JEV es un flavivirus zoonótica 33 que se transmite en la naturaleza entre las aves, cerdos y otros huéspedes vertebrados por mosquitos vectores 34,35. En los seres humanos, la infección por JEV puede causar la enfermedad neurológica encefalitis japonesa a menudo fatal grave (JE), 36 que se produce en Asia y partes del Pacífico occidental, 37,38, con una incidencia anual estimada de ~ 50,000-175,000 casos clínicos. 39,40 El genoma de JEV es un ~ 11 kb, de sentido positivo molécula de ARN de cadena simple y consiste en termina un solo marco de lectura abierto (ORF) flanqueada por dos regiones no codificantes (NCR) en los extremos 5 &#39;y 3&#39;. 41,42 El ORF codifica una poliproteína que se escinde por el anfitrión y proteasas virales para generar 10 proteínas individuales, designada C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5 en el N- a la dirección C-terminal. 34,43,44 Además, un correoforma Xtended de NS1 (NS1) se expresa por -1 frameshifting ribosomal en los codones 8-9 de NS2A. 45,46 De estas 11 proteínas, las tres proteínas estructurales (C, prM y E) son esenciales para la formación de infecciosa viriones, 47,48 y los restantes ocho proteínas no estructurales (NS1 a NS5 y NS1 &#39;) son cruciales para la replicación viral ARN, ensamblaje de partículas 49-51, 52-56 y evasión de la inmunidad innata. 57-59 Tanto el 5&#39; y 3 &#39;NCR contienen conservan secuencias primarias y las estructuras de forma de ARN secundarias / terciarias, 60-62, que son importantes para la modulación de la replicación del ARN viral. 63,64 Este protocolo describe las herramientas, métodos y estrategias para la generación de un larga duración infecciosa BAC de JEV SA 14 -14-2. 28 Este clon BAC funcional contiene una copia completa de ADNc del ARN genómico JEV, 65 que está rodeada por un promotor para la ARN polimerasa SP6 aguas arribadel viral extremo 5 &#39;y un sitio de restricción Xba I único aguas abajo del extremo 3&#39; viral para la transcripción in vitro de escorrentía. Esta tecnología BAC es aplicable a la construcción de un clon de ADNc molecular totalmente funcional para una gran variedad de virus de ARN de cadena positiva.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">1. Molecular Cloning</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2xYT Broth</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">Y2377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">[3H]UTP</td>
			<td style="width:275px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:243px;">NET380250UC</td>
			<td>Radioactive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">50-mL Tube</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific (Nalgene)</td>
			<td style="width:243px;">3114-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">250-mL Bottle</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:243px;">50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose (Low Melting Point)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvaI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0152S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvrII</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0174S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BamHI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsiWI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsrGI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Butanol</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">A399-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cap Analog [m7G(5&#697;)ppp(5&#697;)A]</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">S1405S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">BP1595-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloroform</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C2432</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">DE-81 Filter Paper</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">3658-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18427-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">E. coli DH10B&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18297-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">EDTA</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7637</td>
			<td>Toxic and highly mutagenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">A6283</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Roche</td>
			<td style="width:243px;">10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">I9392</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0918</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">LB Broth</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lithium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Mung Bean Nuclease</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Needle (18G, 20G)</td>
			<td style="width:275px;">BD</td>
			<td style="width:243px;">305196, 305175</td>
			<td>Biohazardous (Sharps waste)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">NotI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Oligonucleotide</td>
			<td style="width:275px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:243px;">Custom Oligonucleotide Synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">PacI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">pBeloBAC11</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol (Buffer-Saturated)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15513-039</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15593-031</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Guanidine Isothiocyanate</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Ambion)</td>
			<td style="width:243px;">10296-010</td>
			<td>Toxic, corrosive, and irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Pme I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">rNTP Set</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">27-2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sealable Polypropylene Tube (16 &#215; 76 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">342413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SfiI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0123S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sma I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SP6 RNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0207S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Spin Column (Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Syringe</td>
			<td style="width:275px;">HSW NORM-JECT</td>
			<td style="width:243px;">4200.000V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tris</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">tRNA (yeast)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">XbaI&#160;</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2. Cell Culture</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Alpha Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">12561-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Conical Tube (50 mL)</td>
			<td style="width:275px;">VWR</td>
			<td style="width:243px;">21008-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Crystal Violet&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Culture Dish (150 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">93150&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cuvette (2-mm Gap)</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">450125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">F1635</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">61100-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Six-Well Plate</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vitamins</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:275px;">Mupid</td>
			<td style="width:243px;">MPDEXU-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">Heracell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Desktop Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Electroporator</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td>
			<td style="width:275px;">UVP</td>
			<td style="width:243px;">UVGL-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">368826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:243px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vortexer</td>
			<td style="width:275px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:243px;">G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Water Bath</td>
			<td style="width:275px;">Jeio Tech</td>
			<td style="width:243px;">WB-10E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Para todos los virus de ARN de cadena positiva, la fiabilidad y la eficiencia de un sistema de genética inversa dependen de la estabilidad genética de un ADNc de longitud completa clonado, cuya secuencia es equivalente a la secuencia consenso de ARN genómico viral. 27 La figura 1 muestra un anillo de cinco estrategia de paso para la construcción de un cDNA infeccioso de longitud completa como un BAC para JEV SA 14 -14-2 28: Paso 1, la purificación de ARN viral a partir del sobrenadante de cultivo celular de células BHK-21 infectadas por el JEV (Figura 1A); Paso 2, la síntesis de cuatro amplicones de ADNc superpuestas (F1 a F4) que abarcan todo el genoma viral (Figura 1B); Paso 3, la subclonación de cada uno de los cuatro fragmentos de ADNc contiguas en un vector BAC, creando pBAC / F1 a pBAC / F4 (Figura 1C); Paso 4, la modificación de los ADNc clonados para la transcripción in vitro el escurrimiento con SP6 ARN polimerasa, es decir, la colocación de un SP6secuencia del promotor inmediatamente corriente arriba del extremo 5 &#39;viral (pBAC / F1 SP6), la eliminación de una pre-existente sitio interno Xba I en el nucleótido 9131 mediante la introducción de una mutación puntual silenciosa, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), y la inserción de un sitio de escorrentía nueva Xba artificial inmediatamente aguas abajo de la viral extremo 3 &#39;(pBAC / F4 RO) (Figura 1 D); y el Paso 5, el montaje de un álbum SA 14 -14-2 ADNc BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (Figura 1E) Tabla. 1 se enumeran los oligonucleótidos utilizados en este procedimiento de clonación. 28 Para la construcción de un ADNc JEV funcional, el primer paso importante es la síntesis de los cuatro fragmentos de ADNc solapados utilizando el ARN viral purificado como molde para la RT-PCR. La Figura 2 proporciona un resultado representativo para los cuatro productos de RT-PCR que eran electroforesis en un 0,8%gel de agarosa. Este gel demuestra claramente que un ADNc de longitud completa JEV se amplifica en cuatro fragmentos de ADNc que se solapan. Ocasionalmente, las reacciones de RT-PCR podrían producir uno o más productos específicos del virus o no específicos que son en su mayoría más pequeño que el producto esperado, debido a la hibridación no específica de los cebadores durante la síntesis de ADNc / amplificación. Por otro lado, poca o ninguna espera que el producto de RT-PCR se amplificó debido a la contaminación accidental RNasa durante el aislamiento de ARN viral o impropio rendimiento RT-PCR. El siguiente paso clave es la clonación y la modificación de una de longitud completa parcial- o ADNc JEV en BAC, que es un procedimiento relativamente sencillo que utiliza técnicas estándar de ADN recombinante. 69 Figura 3 presenta un resultado representativo para la purificación del clon BAC que contiene un ADNc de longitud completa de JEV SA 14 -14-2 por bandas en un gradiente de CsCl-EtBr.En este experimento, después de centrifugación durante 16 horas a 401.700 xg, dos bandas distintas, es decir, el E. coli ADN cromosómico anterior y el plásmido de ADN superenrollado BAC a continuación, son visibles en el centro del tubo bajo luz ultravioleta de onda larga. Un volumen mínimo (~ 400 l) de la banda de ADN BAC inferior se recogió cuidadosamente por hacer un agujero con una jeringa en el lado del tubo. Posteriormente, el EtBr se extrajo a partir del ADN de BAC por extracción butanol, y el ADN BAC-EtBr libre se concentró por precipitación con etanol. El paso final es la determinación de la infectividad específica de los RNAs sintéticos transcritas in vitro a partir de longitud completa SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) después de transfección de ARN en las células permisivas (Figura 4). Este paso consiste en tres pasos secuenciales: Paso 1, linealización de los de larga duración SA 14 -14-2 cDNA en el 3 &#39;-end del genoma viral (Figura 4A); Paso 2, la producción de los ARN sintéticos a partir del ADNc linealizado por escorrentía de transcripción (Figura 4B); y el Paso 3, rescate de los virus recombinantes en células BHK-21 transfectadas con los ARN sintéticos (Figura 4C). Experimentalmente, dos clones independientes de pBAC / SA 14 -14-2 fueron linealizados con la digestión XbaI y tratados con MBN para quitar los cuatro-base 5 &#39;saliente generado por la digestión XbaI. Los BAC linealizadas se limpiaron mediante extracción con fenol-cloroformo, seguido de precipitación con etanol. La linealización de los dos BAC purificados se demostró en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 5A). La extracción con fenol-cloroformo debe hacerse con cuidado para asegurarse de que la BAC linealizadas son RNasa libre. Cada uno de los dos BAC linealizadas sirvió como molde de ADNc para la transcripción run-off usando SP6 RNA polimerasa en presencia de la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un análogo de tapa. La integridad de los ARN sintéticos se demostró mediante la ejecución de partes alícuotas de las dos mezclas de reacción de transcripción en un gel de agarosa al 0,6%, junto con una referencia 1 kb escalera de ADN (Figura 5B). En este sencillo ensayo, la banda principal de ARN prominente siempre migra justo por debajo de los 3 kb referencia banda de ADN y que parecía ser agudo. Sin embargo, la degradación de ARN tendría una apariencia manchada en el mismo gel. Un ensayo de centro infeccioso es el estándar de oro para determinar la infectividad específica de los ARN sintéticos. Este ensayo se realizó por electroporación células BHK-21 con muestras de ARN, la siembra de la igualdad de alícuotas de las 10 veces las células diluidas en serie a electroporación en placas de 6 pocillos que contienen células ingenuas BHK-21 (3 × 10 5 células / pocillo), y la superposición de agarosa sobre las monocapas de células. Después de la incubación durante 4 días, las células supervivientes se fijaron con formaldehído y se tiñeron con cristal violeta s unaolución para cuantificar el número de centros infecciosas (placas), que corresponde al número de moléculas de ARN infecciosos entregado en las células (Figura 6A). Puesto que el molde de cDNA usado para la transcripción in vitro se ha demostrado ser no infecciosa, 27 una parte alícuota de la mezcla de reacción de transcripción se usó directamente para la electroporación. La electroporación es el método preferido para la transfección de ARN; Alternativamente, los ARN se pueden transfectar por otros métodos que utilizan liposomas DEAE-dextrano y catiónicos. RNA electroporación es muy eficaz, pero &quot;arco&quot; del pulso eléctrico se produce raramente, si sales están presentes en la reacción de electroporación o si la cubeta de electroporación se reutiliza. La expresión de proteínas virales en las células transfectadas con ARN se examinó mediante ensayos de inmunofluorescencia utilizando un antisuero de conejo anti-NS1 (Figura 6B). La producción de partículas virales acumulados en los sobrenadantes de células transfectadas con ARN fue unaalyzed por ensayos de placa (Figura 6C). Los resultados de estos experimentos muestran claramente que los RNAs sintéticos derivados de cDNA son infecciosos en células permisivas BHK-21, generando un alto título de virus recombinantes. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonucleótido </td><td> Secuencia A (5 &#39;a 3&#39;) </td><td> Posición b </td><td> Polaridad </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1.22 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> HormigaIntuyo </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10952-10977 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956 a 10977 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ejército de reserva </td><td></td><td> Sentido </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 01.14 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10670 hasta 10694 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10954 hasta 10.977 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td colspan="4"> unas secuencias JEV se muestran en letras mayúsculas, y las secuencias de BAC se indican en letras minúsculas. posición b nucleótidos se refiere a la secuencia completa del genoma de JEV SA 14 -14-2 (número de acceso GenBank JN604986). </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Los oligonucleótidos utilizados para la síntesis de ADNc, amplificación por PCR, y mutagénesis de BAC. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figura 1.0; Estrategia para la construcción de un ADNc de longitud completa de JEV SA 14 -14-2 como BAC (A) Aislamiento de ARN viral de partículas JEV.. Se muestra un diagrama esquemático del ARN genómico de JEV SA 14 -14-2. (B) Síntesis de cuatro fragmentos de ADNc superpuestas (F1 a F4) que cubre la totalidad del genoma viral. (C) Subclonación de cuatro fragmentos de ADNc solapados en un vector BAC, creando pBAC / F1 a pBAC / F4. (D) La modificación de los ADNc clonados para la transcripción de escorrentía in vitro. pBAC / F1 SP6 es un derivado de pBAC / F1 que contiene la secuencia del promotor SP6 aguas arriba del extremo 5 &#39;viral. pBAC / F3 KO es un derivado de pBAC / F3 que contiene una mutación silenciosa punto (A → T 9134, asterisco). pBAC / F4 RO es un derivado de pBAC / F4 que contiene un sitio Xba I artificial escorrentía de aguas abajo del extremo 3 &#39;viral. (E </<html> strong&gt;) Asamblea de un álbum SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Figura 2. Síntesis de cuatro fragmentos de ADNc superpuestas (F1 a F4) que abarca la longitud completa de ARN genómico de JEV SA 14 -14-2. Los cuatro productos de RT-PCR se evaluaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. M, escalera de ADN de 1 kb. Los tamaños esperados de los cuatro fragmentos de ADNc se indican en la parte inferior de la imagen de gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. La purificación del BAC que contiene un ADNc de longitud completa de JEV SA 14 -14-2. El plásmido BAC está aislado de E. coli DH10B por el método de lisis alcalina y SDS-purificó adicionalmente por bandas en un gradiente de CsCl-EtBr. Se presenta un ejemplo de la gradiente de CsCl-EtBr usando un tubo de polipropileno sellable 16 × 76 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Figura 4. Visión general de la recuperación de los virus infecciosos de un álbum JEV SA 14 -14-2 ADNc montado en un BAC. (A) Linealización de la plantilla de cDNA. La larga duración JEV BAC se corta conXba I y se trató con MBN. (B) Síntesis de los transcritos de ARN. El ADNc linealizado se transcribe por la ARN polimerasa SP6 en presencia del 7 m G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un análogo de tapa. (C) La recuperación de la JEVs sintético. Los in vitro ARN transcritos se transfectaron en células BHK-21 mediante electroporación, que genera un alto título de virus sintético. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figura 5. Síntesis de los ARN por transcripción in vitro utilizando un JEV BAC de longitud completa como una plantilla de ADNc. (A) Generación de los de larga duración linealizado JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. Dos clones independientes de pBAC/ SA 14 -14-2 (CL.1 y CL.2) se linealizadas por digestión con Xba I y posterior tratamiento con MBN. Los BAC linealizadas se examinan por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. (B) Producción de los ARN sintéticos mediante transcripción escorrentía. Cada uno de los dos BAC linealizadas se usa como una plantilla para la transcripción de ARN polimerasa SP6 escorrentía. Las alícuotas de las dos reacciones de transcripción se ejecutan en un gel de agarosa al 0,6%. M, 1 kb escalera del ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figura 6. infectividad específica de los RNAs sintéticos transcritos a partir de un BAC JEV de longitud completa y la recuperación de virus sintético. Células BHK-21 son de forma simulada a electroporación (Mock) o electroporación con los transcritos de ARN derivados from cada uno de los dos clones independientes de los de larga duración JEV BAC (CL.1 y CL.2). (A) la infectividad del ARN. Las células se recubrieron con agarosa y se tiñeron con violeta cristal a los 4 días después de la transfección. RNA infectividad se determina mediante ensayos de centro infecciosas para estimar la cantidad de ARN infecciosa electroporación en las células (panel izquierdo). Además, se muestran imágenes representativas de centros infecciosos (panel derecho). (B) Expresión de proteínas. Las células se cultivan en portaobjetos de cámara de 4 pocillos. Expresión de la proteína viral en células de ARN-a electroporación en 20 horas después de la transfección (hpt) se analizó mediante ensayos de inmunofluorescencia utilizando un antisuero de conejo anti-NS1 primaria y una cabra conjugado con Cy3 secundario IgG anti-conejo (rojo). Los núcleos se contratiñeron con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (azul). Las imágenes de inmunofluorescencia se superponen en sus diferenciales correspondientes imágenes de contraste de interferencia. (C) de rendimiento Virus. Las células se cultivaron en 150 mm cultura platos. La producción de viriones infecciosos acumulados en los sobrenadantes de cultivo de células de ARN-electroporación en 22 y 40 hpt es examinado por ensayos de placa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

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