Name: lung tumor cell recruitment assay
Uploaded: 2019-02-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung Tumor Cell Recruitment Assay at JoVE.com

ووافق جميع إجراءات تنفيذها مع الفئران "الحيوان البحوث لجنة طوكيو النساء" للجامعة الطبية.
1. ذيل حقن الوريد للخلايا (LLC) سرطان الرئة لويس
<ol><li>الحفاظ على الخلايا LLC في دميم تكملها FCS 10%، في 5% هوميديفيد CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية. ينبغي أن تحتوي على خلايا نظام تعبير بروتين فلور...

<ol>
	<li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+molecular+insights+and+evolving+paradigms.">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li><li>Kaplan, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR1-positive+haematopoietic+bone+marrow+progenitors+initiate+the+pre-metastatic+niche.">VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche.</a> Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).</li><li>Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-mediated+upregulation+of+chemoattractants+and+recruitment+of+myeloid+cells+predetermines+lung+metastasis.">Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis.</a> Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).</li><li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+S100A8-serum+amyloid+A3-TLR4+paracrine+cascade+establishes+a+pre-metastatic+phase.">The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).</li><li>Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+Clara+cell-mediated+homeostatic+inflammation+is+involved+in+lung+metastasis.">Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis.</a> Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).</li><li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+amyloid+A3+binds+MD-2+to+activate+p38+and+NF-&#954;B+pathways+in+a+MyD88-dependent+manner.">Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-&#954;B pathways in a MyD88-dependent manner.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).</li><li>Erler, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+lysyl+oxidase+is+a+critical+mediator+of+bone+marrow+cell+recruitment+to+form+the+premetastatic+niche.">Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche.</a> Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+destabilization+in+the+premetastatic+phase+facilitates+lung+metastasis.">Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis.</a> Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).</li><li>Sceneay, J., Smyth, M. J., M&#246;ller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pre-metastatic+niche:+finding+common+ground.">The pre-metastatic niche: finding common ground.</a> Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).</li><li>Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+circulating+tumor+cells+in+breast+cancer:+A+review.">The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review.</a> The Breast. 23, 552-560 (2014).</li><li>Wolf, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+CCR2+signaling+induced+by+colon+carcinoma+cells+enables+extravasation+via+the+JAK2-Stat5+and+p38MAPK+pathway.">Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway.</a> Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).</li><li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+tumours+modulate+innate+immune+signalling+to+create+pre-metastatic+vascular+hyperpermeability+foci.">Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci.</a> Nature Communications. 4, 1853 (2013).</li><li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eritoran+inhibits+S100A8-mediated+TLR4/MD-2+activation+and+tumor+growth+by+changing+the+immune+microenvironment.">Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment.</a> Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).</li><li>Ieguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM12-cleaved+ephrin-A1+contributes+to+lung+metastasis.">ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis.</a> Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).</li></ol>

من الممكن معالجة مسبقة للفئران مع الأجسام المضادة، والأدوية، وحمية عالية الدهون أو مكيفة ورم المتوسطة قبل حقن الخلايا السرطانية. والخطوة الأكثر صعوبة في هذا التحليل هو حقن الوريد الذيل. نتائج الحقن غير مكتملة في البيانات غير حاسمة. على المنوال الذيل في C57BL/6 الصعوبة بمكان تحديد، أدى إلى فش...

ورم خبيث حسابات لارتفاع معدل الوفيات في أمراض السرطان. ومن وجهة نظر التحقيقات على المستوى الجزيئي، ورم خبيث يمكن تقسيمها إلى خطوات متعددة: بدء الورم على موقع الورم الرئيسي، ونمو الورم الرئيسي والاجتياح المحيطة بالانسجة، إينترافاسيشن، والتداول عن طريق الأوعية الدموية ، التسرب على الأجهزة البعيدة، وإعادة نمو الورم. كل خطوة تنطوي على مجموعات مختلفة من إشارات الجزيئات/1.
تعني الدراسات حتى الآن بالأحداث التي تحدث في الأجهزة البعيدة قبل أن تبدأ الخلايا السرطانية تنتشر في الدم، والذي يعرف أيضا المرحلة ما قبل المنتشر2،3،4،5، 6. كشفت دراسات نموذجية الماوس لدينا أن ييسر مرحلة ما قبل المنتشر الرئة ورم خبيث بإنشاء استجابات التهابية طويلة الأمد وذات المستوى المنخفض في الرئتين. مرحلة ما قبل المنتشر يتميز هايبربيرميبيليتي ثيميكروفاسكولاتوري، وتجنيد خلايا نخاع العظام المشتقة (بمدك)، و upregulation من جزيئات سيتوكين/تشيموكيني-مثل بما في ذلك3،S100A8 و SAA34 . وقد أبلغ أوكسيديز lysyl أن يعدل المصفوفة خارج الخلية في الرئتين إلى تجنيد بمدكس7. وقد كشف تقرير آخر أهمية Angpt2 و MMP3 MMP10 في مرحلة ما قبل المنتشر8. وبعبارة أخرى، التفاعلات المعقدة بين الأورام الأولية ونخاع العظام والأجهزة البعيدة بحاجة إلى تفهم والتضمين بشكل صحيح (على سبيل المثال، باستخدام العقاقير التي تستهدف البروتينات المشاركة في هذه التفاعلات) لمنع ورم خبيث المستقبل9 . لتنظيم مرحلة ما قبل المنتشر، ينبغي أولاً أن تصور وتقييم تدخلات تشخيصية أو علاجية. هنا، نحن تقرير الرئة ورم توظيف خلية مقايسة التي تمكن هذه الدراسة مرحلة ما قبل المنتشر في الرئتين.
ورم الخلايا تحقن مباشرة في الأوعية الدموية للماوس مشابهة لتعميم خلايا الورم في مرضى السرطان، رغم أنه قد تكون هناك اختلافات بين الخلايا المزروعة وتعميم الخلايا السرطانية. تعميم خلايا الورم أنفسهم الخضوع لبعض التغييرات المميزة عند دخول الدورة الدموية من الورم الرئيسي. ومع ذلك، يمكن أن تشكل الخلايا المزروعة الأورام في الفئران العوز عند أنها يتم حقنها في الوريد الذيل. بالإضافة إلى ذلك، في النظام النموذجي الماوس، الأسفار المسماة الخلايا السرطانية يمكن استخدامها التي تسمح لتعقب هذه الخلايا في الجسم. سلوك الخلايا السرطانية بتعميم أمر بالغ الأهمية كما أنها تحدد النتائج في نهاية المطاف في مرضى السرطان10. الدم ليس مكاناً جيدا للبقاء على قيد الحياة من ورم الخلايا2. أنهم بحاجة للهروب من الهجوم عن طريق المضيف المناعي وتحتاج إلى إشارات apoptotic المضادة لمنع المبرمج بسبب الافتقار إلى الدعم المادي. توليد الخلايا السرطانية مع قدرات أعلى من بدء الورم في مواقع المنتشر أكثر ورم العقيدات. إذا كان إظهار الخلايا السرطانية انتحاء جهاز معين، ينبغي التقيد بورم خبيث في تلك الأجهزة معينة. في هذا التحليل، لا يتم تضمين الخطوات الأولية لتتالي المنتشر (نمو الورم الرئيسي والغزو)، وحتى يتم التركيز على التفاعل بين تعميم الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية (خلايا بطانية والخلايا الظهارية، وخلايا الدم). في فحوصات حقن خلية الورم التقليدية، الباحثين يجب أن تنتظر حتى ينمو الورم العقيدات لحجم ملموسة للكشف عن ورم خبيث. وفي هذه الحالة، لا يمكن تحديده كمياً العدد الدقيق للخلايا السرطانية في الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك، تتضمن هذه العملية مرحلة نمو ورم، مما يشير إلى أن عوامل أخرى في الخلايا السرطانية قد تؤثر على النتيجة.
عد تسمية الخلايا السرطانية تحت ستيريوميكروسكوبي fluorescence عملية بسيطة. ستيريوميكروسكوبي يوفر مجال رؤية واسع حيث يمكن تفحص الرئة كاملة. التدفق الخلوي هو أيضا أداة مفيدة أن يعطي على الفور دقة عدد الخلايا السرطانية في الأنسجة. عد الخلايا الفلورسنت في الأنسجة تحت مجهر [كنفوكل] من الممكن أيضا وعرض الصور الأكثر دقة لخلايا الورم المنتشر ولكن أنها تستغرق وقتاً طويلاً وقد تعطي نتائج متحيزة إلا إذا كان يتم احتساب مساحة محددة. والهدف النهائي لهذا التحليل مراقبة مدى سهولة تتراكم الخلايا السرطانية في الرئتين. كما ذكرت سابقا4من3،، في حالة الرئتين في المرحلة ما قبل المنتشر بسبب إشارات تحريضية من الورم الرئيسي، الورم حقن الخلايا المعرضة لتتراكم في الرئتين، مما يعني ضمناً فرص أكبر لورم خبيث في الرئة. قد تخفف من الشروط الأخرى (التهاب المفاصل، الربو، إلخ)، ومعاملتهم بالعوامل المضادة للالتهابات (مثل مكافحة-TNFα) ورم خبيث في الرئة. وهكذا نخلص إلى أن هذا التحليل أداة قوية لتقييم إمكانية الرئة ورم خبيث.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>trace amount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 micrometer mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeling kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MIN26-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung tumor cell recruitment assay

للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تحكم ورم خبيث، وقد اقترحت فحوصات مختلفة باستخدام الماوس كحيوان نموذج. هنا، علينا أن نظهر مقايسة بسيطة لتقييم التسرب خلية ورم أو ميكروميتاستاسيس. في هذا التحليل، تم حقن الخلايا السرطانية عن طريق الوريد الذيل، وبعد فترة قصيرة، تم تشريح الرئتين وهضمها لعد الخلايا الورم المسمى المتراكمة. هذا التحليل تخطي الخطوة الأولى في غزو الورم الرئيسي في الأوعية الدموية ويسهل دراسة الأحداث التي وقعت في الجهة البعيدة حيث يحدث ورم خبيث. عدد الخلايا التي تحقن في الأوعية الدموية يمكن أن يكون الأمثل لمراقبة عدد محدود من الانبثاث. وأفيد أن الخلايا اللحمية في الجهاز البعيد الذي يسهم في ورم خبيث. وهكذا، يمكن أن يكون هذا التحليل هو أداة مفيدة لاستكشاف الأدوية العلاجية المحتملة، أو أجهزة لمنع ورم خبيث.

الرئتين يقدم العديد من الخلايا بروتينات فلورية خضراء-ذ ح 2 بعد الحقن (الشكل 1A). تجدر الإشارة إلى أنه ينبغي استبعاد البقع الفلورسنت اكتشفت أيضا في تصفية الحمراء من العد رقم الخلية. الغالبية العظمى من الخلايا LLC تختفي من الرئتين 24 ساعة بعد الحقن (ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Lung Tumor Cell Recruitment Assay at JoVE.com

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

الرئة ورم الخلية تجنيد الإنزيم

ويصف هذه المخطوطة طريقة لقياس تراكم خلية ورم في الرئتين في نموذج حيوان من ورم خبيث.

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الورم حول الآليات الجزيئية للانبثاث. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن تجنيد الخلايا السرطانية داخل عضو بعيد يمكن أن يكون كمية. ابدأ باستخدام كاشف تفكك الخلايا غير الأنزيمية لإزالة سرطان الرئة لويس الذي يعبر عن البروتين الفلوري، أو LLC، من حاوية ثقافتها وفقًا للبروتوكولات القياسية.نقل محلول الخلية الناتجة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر قبل الطرد المركزي، وغسل الطرد المركزي الكريات مرتين في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل. بعد الغسيل الثاني، قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلايا المسام 40 ميكرومتر، وتمييع التعليق إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر تركيز. ثم تحميل الخلايا في حقنة ملليلتر واحدة مجهزة بإبرة قياس 29، وحقن 100 ميكرولتر من الخلايا في الوريد الذيل لكل ثمانية إلى 10 أسابيع، C57-Black-6، فأر ذكر.عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، استخدم المقص لإزالة الجلد من السطح البطني لكل فأر، وقطع الأضلاع والحجاب الحاجز لفضح التجويف الصدري. استخدم إبرة ضخ مجنحة من عيار 25 والأنابيب لطرد 15 ملليلتر من PBS عبر البطين الأيمن ، وإزالة القلب والزعتر. تجتاح القصبة الهوائية مع ملقط، وسحب ما يصل، تشريح الأنسجة الضامة حول القصبة الهوائية، لحصاد الرئتين.ثم غسل الرئتين في برنامج تلفزيوني، وفصل فص واحد للتصور من الخلايا الفلورية في الموقع تحت المجهر الفلوري. لهضم أنسجة الرئة، النرد الأول الفص السد مع مقص، ووضع قطع الرئة في حقنة 10 ملليلتر. إغلاق حقنة مع المكبس، ويؤترمس خمسة ملليلتر من حل الهضم في حقنة، وتحريك المكبس داخل وخارج رمح حقنة حتى يتم نشر أنسجة الرئة في جميع أنحاء الحل.الاستغناء عن الطين الرئة في أنبوب 50 ملليلتر، وهضم الأنسجة على شاكر المتبادل لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بتثفير الأنسجة المتبقية حتى يتم تشتيت خلايا الرئة تمامًا ، وإعادة الأنبوب إلى الشاكر لمدة 30 دقيقة إضافية. ثم تصفية الخلايا من خلال مصفاة المسام 40 ميكرومتر، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.لتحليل خلايا الرئة المعزولة عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة ، قم بإعادة تعليق بيليه في مليلترين من عازل خلايا الدم الحمراء لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم الطرد المركزي بيليه مرتين في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد تكملها 1٪ البوم الدم البقري في غسل. بعد الطرد المركزي الثاني، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى BSA، وتصفية الخلايا من خلال مصفاة المسام 40 ميكرومتر جديدة لتكميم الخلايا السرطانية عن طريق تدفق الخلايا.تقدم الرئتين العديد من الخلايا GFP-LLC بعد ساعتين من الحقن، مع اختفاء الغالبية العظمى من الخلايا من الرئتين في غضون 24 ساعة. لاحظ أنه يجب استبعاد أي بقع فلورية تم اكتشافها داخل عامل التصفية الأحمر من عدد الخلايا. لتأكيد عدد من GFP ذ م م في الرئتين، واحدة من الفصوص يمكن استخدامها لتحليل تدفق cytometric كما ثبت.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن إجراء القسم المجمد هو طريقة أكثر دقة لمراقبة الموقع الدقيق للخلايا السرطانية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, in the case that the KD of the protein of interest has a lethal effect on cells or the anticipated effect of the KD is time-dependent, unconditional KD methods are not appropriate. Conditional systems are more suitable in these cases and have been the subject of much interest. These include Ecdysone-inducible overexpression systems, Cytochrome P-450 induction system1, and the tetracycline regulated gene expression systems. 
The tetracycline regulated gene expression system enables reversible control over protein expression by induction of shRNA expression in the presence of tetracycline. In this protocol, we present an experimental design using functional Tet-ON system in human cancer cell lines for conditional regulation of gene expression. We then demonstrate the use of this system in the study of tumor cell-monocyte interaction.

This protocol serves as a scheme for setting up a functional Tet-ON system in cancer cell lines and its subsequent use, in particular for studying the role of tumor cell-derived proteins in recruitment of monocytes/macrophages to the tumor microenvironment.

الشرطي ضربة قاضية للتعبير الجيني في خطوط خلايا السرطان لدراسة توظيف حيدات/الضامة إلى ورم المكروية

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

نموذج الرئة اللاخلوي والخلوية لدراسة ورم خبيث

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor environment and cell-cell interactions. Identification of cancer and stem cell interactions, including changes in extracellular environment, physical interactions, and secreted factors, might enable the discovery of new therapy options. We combine known co-culture techniques to create a model system for mesenchymal stem cells (MSCs) and cancer cell interactions. In the current study, dental pulp stem cells (DPSCs) and PC-3 prostate cancer cell interactions were examined by direct and indirect co-culture techniques. Condition medium (CM) obtained from DPSCs and 0.4 &#181;m pore sized trans-well membranes were used to study paracrine activity. Co-culture of different cell types together was performed to study direct cell-cell interaction. The results revealed that CM increased cell proliferation and decreased apoptosis in prostate cancer cell cultures. Both CM and trans-well system increased cell migration capacity of PC-3 cells. Cells stained with different membrane dyes were seeded into the same culture vessels, and DPSCs participated in a self-organized structure with PC-3 cells under this direct co-culture condition. Overall, the results indicated that co-culture techniques could be useful for cancer and MSC interactions as a model system.

We provide protocols for evaluation of mesenchymal stem cells isolated from dental pulp and prostate cancer cell interactions based on direct and indirect co-culture methods. Condition medium and trans-well membranes are suitable to analyze indirect paracrine activity. Seeding differentially stained cells together is an appropriate model for direct cell-cell interaction.

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful immunotherapies. Several studies have indicated that tumor infiltrating myeloid cells (e.g., myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and tumor-associated macrophages (TAMs)) suppress cytotoxicity of CD8+ T cells in the tumor microenvironment, and that targeting these regulatory myeloid cells can improve immunotherapies. Here, we present an in vitro assay system to evaluate immune suppressive effects of monocytic-MDSCs and TAMs on the tumor-killing ability of CD8+ T cells. To this end, we first cultured na&#239;ve splenic CD8+ T cells with anti-CD3/CD28 activating antibodies in the presence or absence of suppressor cells, and then co-cultured the pre-activated T cells with target cancer cells in the presence of a fluorogenic caspase-3 substrate. Fluorescence from the substrate in cancer cells was detected by real-time fluorescence microscopy as an indicator of T-cell induced tumor cell apoptosis. In this assay, we can successfully detect the increase of tumor cell apoptosis by CD8+ T cells and its suppression by pre-culture with TAMs or MDSCs. This functional assay is useful for investigating CD8+ T cell suppression mechanisms by regulatory myeloid cells and identifying druggable targets to overcome it via high throughput screening.

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We describe here a protocol to investigate cytotoxicity of pre-activated CD8+ T cells against cancer cells by detecting apoptotic cancer cells via real-time microscopy. This protocol can investigate mechanisms behind myeloid cell-induced T cell suppression and evaluate compounds aimed at replenishing T cells via blockade of immune suppressive myeloid cells.

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

شبه التلقائي PD-L1 توصيف وتعداد الخلايا السرطانية المتداولة من غير الصغيرة خلية سرطان الرئة المرضى عن طريق الفلورة المناعية

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

في المختبر الاختبار لدراسة التفاعل الورم الضامة

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

الكشف عن تطور ورم الرئة في الفئران عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...