Name: lung tumor cell recruitment assay
Uploaded: 2019-02-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung Tumor Cell Recruitment Assay at JoVE.com

כל ההליכים שבוצעו עם עכברים אושרו על-ידי האוניברסיטה לרפואה חיה מחקר הוועדה של טוקיו של הנשים.
1. הזנב הזרקה לווריד של לואיס ריאות (LLC) קרצינומה של תאים
<ol><li>לשמור על LLC בתאים DMEM בתוספת 10% FCS, ב- 5% humidified חממה2 CO ב 37 º C. תאים צריך להכיל מערכת ביטוי חלבון פלואורסצנטי (למשל, </em...

<ol>
	<li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+molecular+insights+and+evolving+paradigms.">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li><li>Kaplan, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR1-positive+haematopoietic+bone+marrow+progenitors+initiate+the+pre-metastatic+niche.">VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche.</a> Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).</li><li>Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-mediated+upregulation+of+chemoattractants+and+recruitment+of+myeloid+cells+predetermines+lung+metastasis.">Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis.</a> Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).</li><li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+S100A8-serum+amyloid+A3-TLR4+paracrine+cascade+establishes+a+pre-metastatic+phase.">The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).</li><li>Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+Clara+cell-mediated+homeostatic+inflammation+is+involved+in+lung+metastasis.">Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis.</a> Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).</li><li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+amyloid+A3+binds+MD-2+to+activate+p38+and+NF-&#954;B+pathways+in+a+MyD88-dependent+manner.">Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-&#954;B pathways in a MyD88-dependent manner.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).</li><li>Erler, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+lysyl+oxidase+is+a+critical+mediator+of+bone+marrow+cell+recruitment+to+form+the+premetastatic+niche.">Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche.</a> Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+destabilization+in+the+premetastatic+phase+facilitates+lung+metastasis.">Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis.</a> Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).</li><li>Sceneay, J., Smyth, M. J., M&#246;ller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pre-metastatic+niche:+finding+common+ground.">The pre-metastatic niche: finding common ground.</a> Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).</li><li>Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+circulating+tumor+cells+in+breast+cancer:+A+review.">The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review.</a> The Breast. 23, 552-560 (2014).</li><li>Wolf, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+CCR2+signaling+induced+by+colon+carcinoma+cells+enables+extravasation+via+the+JAK2-Stat5+and+p38MAPK+pathway.">Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway.</a> Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).</li><li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+tumours+modulate+innate+immune+signalling+to+create+pre-metastatic+vascular+hyperpermeability+foci.">Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci.</a> Nature Communications. 4, 1853 (2013).</li><li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eritoran+inhibits+S100A8-mediated+TLR4/MD-2+activation+and+tumor+growth+by+changing+the+immune+microenvironment.">Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment.</a> Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).</li><li>Ieguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM12-cleaved+ephrin-A1+contributes+to+lung+metastasis.">ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis.</a> Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).</li></ol>

טיפול קדם של עכברים עם נוגדנים, תרופות, תזונה עתירת שומן או ממוזגים-גידול בינוני לפני הזרקת תאי הגידול הוא אפשרי. השלב הקשה ביותר זה וזמינותו היא הזריקה וריד הזנב. הזרקת לא שלם תוצאות חד משמעיות נתונים. וריד הזנב ב- C57BL/6 קשה במיוחד לזהות, וכתוצאה מכך זריקות שנכשלו. הנחת העכבר על כרית החימום (37...

גרורות הגידול חשבונות עבור תמותה גבוהה במחלות הקשורים לסרטן. מנקודת מבט של חקירות ברמה המולקולרית, גרורות ניתן לחלק מספר השלבים: גידול חניכה הגידול העיקרי באתר, הגידול העיקרי ו הפלישה לתוך סביב רקמות, intravasation, זרימת הדם דרך כלי הדם , extravasation איברים רחוקים, וכן גידול מחדש את הצמיחה. כל שלב כרוך סטים שונים של מולקולות/אותות1.
מחקרים עד כה מעורב עם אירועים המתרחשים באיברים מרוחקים לפני לתאי הגידול במחזור הדם, אשר נקרא גם שלב גרורתי מראש2,3,4,5, 6. המחקרים שלנו דגם העכבר חשף כי שלב גרורתי מראש מקלה על גרורות ריאה על-ידי יצירת תגובות דלקתיות לטווח ארוך, ברמה נמוכה של הריאות. שלב טרום גרורתי מאופיין על-ידי hyperpermeability של themicrovasculature, גיוס של תאים במח העצם נגזר (BMDC), קולטנים upregulation של מולקולות ציטוקין/כימוקין-כמו כולל3,S100A8 ו- SAA34 . בעבר דווח שכי אוקסידאז lysyl משנה של מטריצה חוץ-תאית בריאות לגייס BMDCs7. דוח אחר חשף את החשיבות של Angpt2, MMP3 ו- MMP10 שלב גרורתי מראש8. במילים אחרות, מורכבות האינטראקציות בין גידולים העיקרי, מח עצם, ואיברים מרחוק צריך להיות מובן, מאופנן כראוי (למשל, באמצעות תרופות המיועדות החלבונים המעורבים אינטראקציות אלה) כדי למנוע בעתיד גרורות9 . כדי להסדיר את שלב גרורתי מראש, הוא צריך קודם להיות דמיינו, שחושבה עבור התערבויות אבחון או טיפולית. כאן, אנחנו מדווחים על ריאות הגידול תא גיוס assay המאפשרת הלימוד של שלב טרום גרורות בריאות.
תאים סרטניים מוזרק ישירות כלי הדם של העכבר דומים מחזורי תאים סרטניים חולי סרטן, אם כי ייתכנו הבדלים בין תאים בתרבית ופיזור תאים סרטניים. מחזורי תאים סרטניים עצמם עוברים שינויים אופייניים כאשר הם מזינים את זרימת הדם מן הגידול העיקרי. עם זאת, תאים בתרבית יכולים ליצור את גידולים בעכברים immunodeficient כשהם מוזרקים בווריד הזנב. בנוסף, במערכת מודל העכבר, זריחה עם התווית תאים סרטניים יכולים לשמש לאפשר מעקב של תאים אלה בגוף. ההתנהגות של מחזורי תאים סרטניים חיוני כפי שהם קובעים את ההשלכות האולטימטיבי חולי סרטן10. דם אינו מקום טוב להישרדות של תאי גידול2. הם צריכים לברוח מפני התקפה על ידי המערכת החיסונית מארח וזקוקים אנטי-מוות אותות כדי למנוע אפופטוזיס עקב חוסר תמיכה פיזית. תאים סרטניים עם יכולות גבוהות יותר של הגידול חניכה באתרים גרורתי להפיק יותר גושים סרטניים. אם תאים סרטניים מראים tropism איבר מסוים, גרורות להתייחס באיברים האלה מסוים. זה assay, השלבים הראשונים של המפל גרורתי (הגידול העיקרי ואת הפלישה) אינם כלולים ולאחר אז הדגש הוא על האינטראקציה בין מחזורי תאים סרטניים ותאים סטרומה (תאי אנדותל בתאי אפיתל, תאי דם). בגידול קונבנציונאלי מבחני הזרקת תא, חוקרים צריכים לחכות עד גושים סרטניים לגדול לגודל מוחשי כדי לזהות את גרורות. במקרה זה, המספר המדויק של תאי גידול כלי דם לא ניתן לכמת. בנוסף, תהליך זה כולל הגידול שלב לצמיחה מחודשת, המציין כי גורמים אחרים בתאי הגידול עשוי להשפיע על התוצאה.
ספירת שכותרתו תאים סרטניים תחת stereomicroscope קרינה פלואורסצנטית היא תהליך פשוט. Stereomicroscope מספק שדה ראייה רחב כך ניתן לסרוק את כל הריאה. Cytometry זרימה הוא גם כלי שימושי שנותן באופן מיידי מספר מדויק של תאים סרטניים ברקמה. ספירת תאים פלורסנט ברקמה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי אפשרי גם ומציג את התמונות המדויקות ביותר של תאים סרטניים גרורתי, אולם היא גוזלת זמן, עלולה להחזיר תוצאות מוטה אם רק אזור שנבחר נספרת. המטרה האולטימטיבית של זה וזמינותו היא לבחון איך בקלות תאים סרטניים להצטבר בתוך הריאות. כפי שדווח בעבר3,4, אם הריאות הן בשלב טרום גרורתי עקב איתות דלקתיות מן הגידול העיקרי, לתאי הגידול מוזרק נוטים להצטבר הריאות, ובכך רומז גבוהה יותר הסיכויים גרורות ריאה. תנאים אחרים (דלקת מפרקים שגרונית, אסטמה, וכו '), והטיפול עם סוכנים אנטי דלקתי (כגון אנטי-TNFα) עשוי להחליש גרורות ריאה. לפיכך, אנו מסיקים כי assay הזה הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את האפשרות של גרורות ריאה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>trace amount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 micrometer mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeling kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MIN26-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung tumor cell recruitment assay

כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המסדירים גרורות הגידול, הוצעו מבחני שונים באמצעות העכבר כחיה מודל. . הנה, נדגים וזמינותו פשוט להעריך הגידול תא extravasation או micrometastasis. ב הזה assay, תאים סרטניים הוזרקו דרך הווריד של הזנב, ו לאחר תקופה קצרה, הריאות היו גזור מתעכל לספור את תאי הגידול שכותרתו שהצטברו. Assay זה מדלג על השלב הראשוני של הגידול העיקרי הפלישה לתוך כלי דם ואסטמה ומקילה על המחקר של אירועים באיבר מרוחק שבו מתרחשת גרורות הגידול. ניתן למטב את מספר התאים מוזרק לתוך כלי הדם להתבונן במספר מצומצם של גרורות. בעבר דווח כי סטרומה תאים באיבר מרוחק לתרום גרורות. לפיכך, וזמינותו הזה יכול להיות כלי שימושי כדי לחקור תרופות טיפוליות או התקנים למניעת גרורות הגידול.

הריאות מציגים GFP-אינק הרבה תאים 2 h לאחר ההזרקה (איור 1 א'). יצוין, כי המקומות פלורסנט זוהה גם במסנן אדום לא להיות כלולים ספירת מספר. הרוב המכריע של תאים LLC נעלמים מן הריאות 24 שעות לאחר ההזרקה (איור 1C).
כדי לאשר את...

Watch this Scientific Journal Video about Lung Tumor Cell Recruitment Assay at JoVE.com

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

ריאות הגידול תא גיוס Assay

כתב יד זה מתאר שיטה לכמת הצטברות תאים גידול בריאות במודל חיה של גרורות הגידול.

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הגידול על המנגנונים המולקולריים של גרורות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי גיוס של תאים סרטניים בתוך איבר מרוחק ניתן לכמת. התחל על ידי שימוש ריאגנט דיסוציאציה תאים שאינם אנזימטיים כדי להסיר חלבון פלואורסצנטי מבטא קרצינומה ריאות לואיס, או LLC, תאים ממכל התרבות שלהם על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.העבר את פתרון התא וכתוצאה מכך לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר לפני צנטריפוגה, צנטריפוגה לשטוף את כדורי פעמיים בחמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, מסננים את התאים דרך מסננת תאי נקבוביות של 40 מיקרומטר, ומדללים את ההשעיה לריכוז של פי 10 לששת התאים למיליליטר. ואז לטעון את התאים לתוך מזרק אחד מיליליטר מצויד מחט 29-מד, ולהזריק 100 microliters של תאים לתוך וריד הזנב של כל שמונה עד 10 שבועות, C57-שחור-6, עכבר זכר.בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השתמש במספריים כדי להסיר את העור מפני השטח הגחוניים של כל עכבר, וחתוך את הצלעות והסרעפת כדי לחשוף את חלל בית החזה. השתמש מחט עירוי מכונף 25-מד צינורות כדי לשטוף 15 מיליליטר של PBS דרך החדר הימני, ולהסיר את הלב ואת התימוס. אוחז את קנה הנשימה עם מלכודות, למשוך למעלה, לנתח את רקמות החיבור סביב קנה הנשימה, כדי לקצור את הריאות.ואז לשטוף את הריאות PBS, ולנתק אונה אחת להדמיה של התאים הפלואורסצנטיים במקום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לעכל את רקמת הריאה, ראשית קוביות האונה caudal עם מספריים, ולמקם את חתיכות הריאה במזרק 10 מיליליטר. סגור את המזרק עם הבוכנה, ושואפ חמישה מיליליטר של פתרון עיכול לתוך המזרק, הזזת הבוכנה פנימה ומחוץ לפיר המזרק עד רקמת הריאה מופץ לאורך כל הפתרון.מחלקים את תרחיף הריאה לצינור 50 מיליליטר, ולעכל את הרקמה על שייקר הדדי במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 150 סל"ד. בסוף הדגירה, triturate הרקמה הנותרת עד תאי הריאה מפוזרים לחלוטין, ולהחזיר את הצינור שייקר במשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן לסנן את התאים דרך מסננת נקבוביות 40 מיקרומטר, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.כדי לנתח את תאי הריאה המבודדים על ידי ציטומטריית זרימה, להשתמש שוב את גלולה בשני מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. ואז צנטריפוגה גלולה פעמיים בחמישה מיליליטר של PBS טרי בתוספת 1% אלבומין סרום בקר לכל לשטוף. לאחר הצנטריפוגה השנייה, יש למצות את גלולת הכדור במיליליטר אחד של PBS טרי בתוספת BSA, ולסנן את התאים באמצעות מסננת נקבוביות חדשה של 40 מיקרומטר לכימות תאי הגידול על ידי ציטומטריית זרימה.הריאות מציגות תאים רבים GFP-LLC שעתיים לאחר ההזרקה, עם הרוב המכריע של התאים נעלמים מן הריאות בתוך 24 שעות. שים לב שיש לא לכלול בספירת התאים כתמים פלואורסצנטיים שזוהו בתוך המסנן האדום. כדי לאשר את מספר GFP-LLC בריאות, אחת האונות יכולה לשמש לניתוח ציטומטרי זרימה כפי שהודגם.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי הליך סעיף קפוא היא שיטה מדויקת יותר להתבוננות במיקום המדויק של תאים סרטניים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, in the case that the KD of the protein of interest has a lethal effect on cells or the anticipated effect of the KD is time-dependent, unconditional KD methods are not appropriate. Conditional systems are more suitable in these cases and have been the subject of much interest. These include Ecdysone-inducible overexpression systems, Cytochrome P-450 induction system1, and the tetracycline regulated gene expression systems. 
The tetracycline regulated gene expression system enables reversible control over protein expression by induction of shRNA expression in the presence of tetracycline. In this protocol, we present an experimental design using functional Tet-ON system in human cancer cell lines for conditional regulation of gene expression. We then demonstrate the use of this system in the study of tumor cell-monocyte interaction.

This protocol serves as a scheme for setting up a functional Tet-ON system in cancer cell lines and its subsequent use, in particular for studying the role of tumor cell-derived proteins in recruitment of monocytes/macrophages to the tumor microenvironment.

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor environment and cell-cell interactions. Identification of cancer and stem cell interactions, including changes in extracellular environment, physical interactions, and secreted factors, might enable the discovery of new therapy options. We combine known co-culture techniques to create a model system for mesenchymal stem cells (MSCs) and cancer cell interactions. In the current study, dental pulp stem cells (DPSCs) and PC-3 prostate cancer cell interactions were examined by direct and indirect co-culture techniques. Condition medium (CM) obtained from DPSCs and 0.4 &#181;m pore sized trans-well membranes were used to study paracrine activity. Co-culture of different cell types together was performed to study direct cell-cell interaction. The results revealed that CM increased cell proliferation and decreased apoptosis in prostate cancer cell cultures. Both CM and trans-well system increased cell migration capacity of PC-3 cells. Cells stained with different membrane dyes were seeded into the same culture vessels, and DPSCs participated in a self-organized structure with PC-3 cells under this direct co-culture condition. Overall, the results indicated that co-culture techniques could be useful for cancer and MSC interactions as a model system.

We provide protocols for evaluation of mesenchymal stem cells isolated from dental pulp and prostate cancer cell interactions based on direct and indirect co-culture methods. Condition medium and trans-well membranes are suitable to analyze indirect paracrine activity. Seeding differentially stained cells together is an appropriate model for direct cell-cell interaction.

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful immunotherapies. Several studies have indicated that tumor infiltrating myeloid cells (e.g., myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and tumor-associated macrophages (TAMs)) suppress cytotoxicity of CD8+ T cells in the tumor microenvironment, and that targeting these regulatory myeloid cells can improve immunotherapies. Here, we present an in vitro assay system to evaluate immune suppressive effects of monocytic-MDSCs and TAMs on the tumor-killing ability of CD8+ T cells. To this end, we first cultured na&#239;ve splenic CD8+ T cells with anti-CD3/CD28 activating antibodies in the presence or absence of suppressor cells, and then co-cultured the pre-activated T cells with target cancer cells in the presence of a fluorogenic caspase-3 substrate. Fluorescence from the substrate in cancer cells was detected by real-time fluorescence microscopy as an indicator of T-cell induced tumor cell apoptosis. In this assay, we can successfully detect the increase of tumor cell apoptosis by CD8+ T cells and its suppression by pre-culture with TAMs or MDSCs. This functional assay is useful for investigating CD8+ T cell suppression mechanisms by regulatory myeloid cells and identifying druggable targets to overcome it via high throughput screening.

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We describe here a protocol to investigate cytotoxicity of pre-activated CD8+ T cells against cancer cells by detecting apoptotic cancer cells via real-time microscopy. This protocol can investigate mechanisms behind myeloid cell-induced T cell suppression and evaluate compounds aimed at replenishing T cells via blockade of immune suppressive myeloid cells.

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

זיהוי של התקדמות הגידול ריאה בעכברים על ידי הדמיה אולטרסאונד

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...