Name: identification of rare bacterial pathogens by 16s rrna gene sequencing and maldi-tof ms
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS at JoVE.com

The authors would like to thank Prof. Enno Jacobs for his continuing support.

1. Estrazione del DNA batterico <ol><li> Preparazione della Soluzione PBS <ol><li> Pesare 1,65 g di Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g di NaH 2 PO 4 x 2H 2 O e 8,80 g di NaCl in un pallone e riempire con acqua distillata fino ad un volume finale di 1000 ml. Regolare il pH a 7,4. Per l&#39;uso finale filtrare la soluzione attraverso un batterio a prova (0,22 micron) Filtro. </li></ol></li><li> I batteri DNA Estrazione di Gram-negativi <ol><li> Streak il materia...

Entrambi MALDI-TOF MS e 16S rRNA gene sequenziamento offrono la possibilità di individuare un gran numero di batteri diversi. MALDI-TOF MS è un metodo veloce ed economico, che è facile da maneggiare e grandi database di spettri di massa batterica sono disponibili. Per questo motivo, MALDI-TOF MS è un metodo efficace e affidabile rapida costo per condurre studi di screening focalizzati in rare batteri patogeni 17,20,39,51. In uno studio prospettico confrontando MALDI-TOF MS con altri metodi di identificazi...

l&#39;identificazione sicura dei patogeni rari nella diagnostica di routine è ostacolata dal fatto che i metodi culturali e biochimici classici sono ingombranti e talvolta discutibili. Inoltre, un laboratorio di microbiologia diagnostica deve elaborare un gran numero di agenti patogeni, che vanno da poche centinaia a diverse migliaia, giornaliero, che richiede l&#39;uso di sistemi automatizzati. Oltre alla gestione di una elevata produttività giornaliera, è necessaria la precisa identificazione di specie batteriche. Questo è giustificato dal momento che si differenziano per il loro modello di sensibilità agli antibiotici e, pertanto, la corretta identificazione fornisce al clinico informazioni essenziali per scegliere antibiotici appropriati (per esempio, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43. sistemi di identificazione microbici automatizzati (AMIS) si applicano insiemi standard di reazioni enzimatiche per caratterizzare le proprietà metaboliche di isolati batterici <sup&gt; 13,15,16,26,27. Sebbene le cartucce utilizzate in questi sistemi utilizzano un gran numero di diverse reazioni biochimiche, ad esempio, 47 nella scheda GN del AMIS utilizzato in questo studio 52, questo permette strategia identificazione sicura solo per un numero limitato di batteri. Inoltre, la banca dati, un sistema esperto avanzata, è chiaramente focalizzata sulla rilevazione di batteri pertinenti e altamente rilevanti di importanza medica 13,15,16,36. Due ulteriori sistemi, ampiamente utilizzati nei laboratori, si applicano anche questo approccio biochimico per l&#39;identificazione batterica. Recenti studi dimostrano una precisione di identificazione comparabili tra Amis utilizzati in questo studio e uno dei concorrenti (93,7% e 93,0%, rispettivamente), mentre il 3 ° AMIS ha una precisione di identificazione del solo 82,4% sulle specie di livello 35. Tali discrepanze possono essere spiegate dalla qualità dei riferimenti ai dati di identificazione sottostanti, le versioni di kit e software, differenze di metaboLISM e la competenza del personale tecnico 35,36. Due sistemi MALDI-TOF MS automatizzati (sistema di identificazione microbica MALDI-TOF, MMI) sono usati principalmente. Questi sistemi consentono il rilevamento di un gran numero di specie batteriche sulla base della loro proteina spettri di massa di impronte digitali. Ad esempio, il database delle MMIS utilizzati contiene 6.000 spettri di riferimento. Sistemi di identificazione basati sulla spettrometria di massa offrono il rilevamento veloce e affidabile di una grande varietà di microrganismi patogeni tra cui rari 11,48,51. Fino ad oggi solo pochi confronti diretti sono disponibili tra i MMI utilizzati in questo studio e il suo concorrente 19,33. Secondo dæk et al. Entrambi i sistemi forniscono un alto tasso di accuratezza analoga identificazione, ma le MMI utilizzati in questo studio sembra essere più affidabile nell&#39;identificazione delle specie 19. Allo stesso modo, le tecniche molecolari indirizzamento ben conservato, ma anche geni distinti ( <em&gt; ad esempio, 16S rDNA o rpoB) permettono una chiara identificazione delle specie 3,22,61. Tra questi, il 16S rDNA è il gene housekeeping più utilizzato per la sua presenza in tutti i batteri 34. La sua funzione rimane invariato e, infine, con circa 1500 bp, è abbastanza lungo per essere adatto per bioinformatica 14,34. Molti ricercatori considerano l&#39;analisi del gene 16S rRNA come il &quot;gold standard&quot; per l&#39;identificazione batterica 21. Ciò è dovuto al fatto che alcuni laboratori utilizzano tecniche di ibridazione DNA-DNA alla data di identificazione di rare o nuovi batteri 14,34. Inoltre, sempre più banche dati sono disponibili che possono essere utilizzati per 16S rRNA analisi del gene 50. Tuttavia, si deve tenere conto che i sistemi di rilevamento basati 16S rDNA hanno una sensibilità limitata rispetto ai protocolli PCR standard. Inoltre, l&#39;approccio molecolare è sofisticato, tempo e richiede personale altamente qualificato estrutture di laboratorio dedicate e, quindi, non facilmente implementato in diagnostica di routine 55. Inoltre, è stato dimostrato che la combinazione di almeno due diversi metodi di identificazione batterica conduce ad altamente accurata identificazione del ceppo. La combinazione di MALDI-TOF MS e sequenziamento del 16S rDNA consente l&#39;identificazione di un gran numero di differenti specie batteriche con elevata precisione. Recentemente la combinazione di analisi del gene MALDI-TOF MS e 16S rRNA è stata presentata per l&#39;identificazione batterica studiare domande epidemiologici e agenti patogeni rari 56.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>270733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser LT</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85600</td>
			<td>Oscillating Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-beads 1,0mm</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>412-2917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer 5436</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq PCR Core Kit (1000 U)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>201225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Forward Primer TPU1 (5&#180;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3&#8217;)</td>
			<td rowspan="2">biomers.net GmbH, Ulm, Germany&#160;</td>
			<td rowspan="2">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Reverse Primer RTU4 (5&#180;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&#180;)</td>
			<td rowspan="2">biomers.net GmbH, Ulm, Germany&#160;</td>
			<td rowspan="2">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Thermocylcer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube 1.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube 2 mL</td>
			<td>SARSTEDT, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,693,005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 8er-CapStrips</td>
			<td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td>711040X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 8er-SoftStrips</td>
			<td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td>711030X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp R-ZV11&#160;</td>
			<td>Sharp Electronics, Hamburg, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Microwave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1084211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td rowspan="2">Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td rowspan="2">849006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2 x 500 g)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartLadder SF - 100 to 1000 bp</td>
			<td>Eurogentec, L&#252;ttich, Belgium</td>
			<td>MW-1800-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (25 g)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF (10 g)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ComPhor L Maxi&#160;</td>
			<td>Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1&#160;%(10 mL)</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc 2000</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Gel-documentation system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT (500 reactions)</td>
			<td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom</td>
			<td>78201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer (10 x) with EDTA&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>402824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator Kit v1.1</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide (25 mL)</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyeEx 2.0 Spin Kit (250)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>63206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Sequenzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4306737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4317237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4317241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer, well plate septa</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4315933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4333466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Analysis Software 5.4</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microflex (the MALDI TOF MS maschine)</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system)</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>our mMIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITEK MS&#160;</td>
			<td>bioM&#233;rieux, N&#252;rtingen, Germany&#160;</td>
			<td></td>
			<td>2nd mMis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexControl 3.4 (control software)</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software)</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1&#160;g</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>201344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Calibration Standard II</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>222570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSP 96 target polished steel</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>8224989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqgreen&#160;</td>
			<td>peqlab&#160;</td>
			<td>37-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI Biotyper Galaxy&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>Part No. 1836007&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitek 2&#160;</td>
			<td>bioM&#233;rieux, N&#252;rtingen, Germany&#160;</td>
			<td></td>
			<td>our aMis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroScan&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td></td>
			<td>2nd aMis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Phoenix&#8482; Automated Microbiology System</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>3rd aMis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus&#160;subsp.&#160;aureus&#160;Rosenbach (ATCC&#174;&#160;25923&#8482;)</td>
			<td>ATCC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>postive control for PCR&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of rare bacterial pathogens by 16s rrna gene sequencing and maldi-tof ms

Ci sono un certo numero di batteri patogeni rare e, quindi, non sufficientemente descritto che sono riportati per causare infezioni gravi specialmente nei pazienti immunocompromessi. Nella maggior parte dei casi solo pochi dati, per lo più pubblicati come case report, sono disponibili che indagare il ruolo di tali agenti patogeni come un agente infettivo. Pertanto, al fine di chiarire il carattere patogeno di tali microrganismi, è necessario condurre studi epidemiologici che comprendono un gran numero di questi batteri. I metodi utilizzati in uno studio tale sorveglianza devono soddisfare i seguenti criteri: l&#39;identificazione dei ceppi deve essere accurata secondo la nomenclatura valida, dovrebbero essere facili da maneggiare (robustezza), economico nella diagnostica di routine e devono generare comparabili risultati tra i diversi laboratori. In generale, ci sono tre strategie per l&#39;identificazione di ceppi batterici in un ambiente di routine: 1) Identificazione fenotipica che caratterizza la BioChemicaL e metaboliche proprietà dei batteri, 2) tecniche di biologia molecolare, come 16S rRNA sequenziamento del gene e 3) spettrometria di massa come un approccio basato romanzo proteoma. Poiché spettrometria di massa e approcci molecolari sono gli strumenti più promettenti per identificare una grande varietà di specie batteriche, sono descritti questi due metodi. I progressi, limitazioni e potenziali problemi quando si utilizzano queste tecniche sono discusse.

MALDI-TOF MS è un romanzo, metodo veloce ed economico per la diagnostica di routine microbiologici. Batterica identificazione della specie da MALDI-TOF MS produce spettri principalmente composto da proteine ​​ribosomali, ma anche altri &quot;proteine ​​molto conservato con funzioni di house-keeping colpite in misura minima dalle condizioni ambientali&quot; 17 banca dati .La di questa MMIS contiene un grande insieme di spettri di riferimento e anche i batteri, che rara...

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Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

The overall goal of this MALDI-TOF Mass Spectrometry protocol is to improve typing of rare pathogens through a rapid and cost-effective procedure. This method can help to answer key questions in the field of diagnostic microbiology, it allows rapid edification of rare bacterial pathogens. Today, we want to talk about odoratimimus and bacteria of the genus Myroides.To demonstrate the method and to talk about the interpretation of the results. Generally, individuals new to this method might find it difficult since transfer of bacteria, overlay with metrics, and interpretation of results require technical skills and microbiological expertise. We first had the idea to use MALD-TOF MS to screen for rare bacteria when we had a patient in our hospital suffering from a diabetic food infection caused by myroides odoratimus.Begin this protocol with the extraction of bacterial DNA, 16S ribosomal DNA PCR and Sanger sequencing as described in the text protocol. Use a wooden toothpick to transfer a single bacterial colony to a well of a 96 well steel target. Spot one microliter of 70%formic acid on top of the air-dried organism on the steel target, and leave to dry for approximately two to three minutes.Overlay the spot with one microliter of matrix solution containing 50 mg/ml of CHCA in an organic solvent composed of 50%acetonitrile, 2.5 trifluoroacetic acid, and 47.5%water. Let the smear and overlaid matrix air dry for about five minutes in a hood. To introduce the samples, aerate the sample loading port of the mass spectrometer by pressing the in/out button of the instrument.Open the loading port and insert the MALDI-TOF MS target plate with the dried bacterial smear plus matrix. Close the port and evacuate again. Observe the vacuum and when it reaches 4.5 million millibar start the measurement.Open the MMIS analysis software and click the file menu. Select New Classification"and a new window called MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard"should open. Type the project name in the field Project Name"and click New, under the new dialogue box named New Project, check the project name and proceed by clicking the Okay"button.In the MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard, observe the Analyte placement window. Select target positions, right click any selected position, and select Add samples. In the automatically opened table view, type in the sample name, sample ID, and optionally, a comment.Click the Next"button to proceed. Next, observe the selection of MALDI Biotyper methods window. Select Bruker Taxonomy"from the MSPs from Taxonomy Trees and click Next"to continue.Then, observe the project summary window. Check the inserted entries given above for the actual classification project. Start the classification run by clicking the Finish"button.Measurements start automatically when the appropriate vacuum is reached. Follow the classification run until the measurement is successfully completed. Once the measurement is complete, open the menu View"and click Results"to view the results table in the MALDI Biotyper Real Time Classification Project One.View the Bruker-Daltonik MALDI Biotyper classification results as an html file in the default web browser. Print and save the results. Shown here are spectra obtained by MALDI-TOF MS that are measured and classified in real time.The spectra are assigned a species name and a score value reflecting the quality of the measurement. Scores above 2.300 represent a highly-probable species identification. A score between 2.000 and 2.300 indicates a secure species identification.A score below 1.700 and 2.000 designates a probable species identification. And a score below 1.700 is non-reliable. The identification of bacterial pathogens grown on a pure culture on a solid medium takes two to three minutes.It is important to remember that rare bacteria pathogens can only be found with MALDI-TOF MS when the instruments reliably contains the appropriate spectra. Otherwise, it has to be expunged by integrating MaSDA spectra from typed strains of their characterized isolates. In the case where score results do not lead to an unequivocal strain identification, further methods, such as biochemical profiling or 16S rDNA sequencing can be applied.Though this method can provide insight into bacterial detection, it can also be applied to other microorganisms such as fungi or anaerobes. Furthermore, bacteria-resistance can be measured. Don't forget working with a matrix which is a hazardous substance, wear gloves, protective goggles, and work under a hood.Furthermore, it is absolutely necessary to dry the matrix and smear thoroughly to avoid splash overs in the analyzation chamber.

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