Name: identification of rare bacterial pathogens by 16s rrna gene sequencing and maldi-tof ms
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS at JoVE.com

The authors would like to thank Prof. Enno Jacobs for his continuing support.

細菌DNAの1の抽出<ol><li> PBS溶液の調製<ol><li> 1.65グラムのNa 2フラスコ中HPO 4×2H 2 O、0.22グラムのNaH 2 PO 4×2H 2 Oおよび8.80グラムのNaClを秤量し、千ミリリットルの最終容量まで蒸留水で満たします。 pHを7.4に調整します。最終的な使用のための細菌プルーフ（0.22μm）のフィルターを通して溶液をろ過します。 </li></ol></li><li>グラム陰性細菌のDNA抽?...

MALDI-TOF MS及び16S rRNA遺伝子配列の両方が異なる細菌の多くを同定する可能性を提供します。 MALDI-TOF MSは、取り扱いが容易であり、細菌の質量スペクトルの大規模なデータベースが利用可能で、高速かつ安価な方法です。このため、MALDI-TOF MSはまれな細菌性病原体17,20,39,51に焦点を当てたスクリーニング研究を実施するための迅速でコスト効率と信頼性の高い方法です。他の表現型の?...

診断ルーチンでは珍しい病原体のセキュアな識別は、古典的、文化的、生化学的方法が煩雑と時々疑問であるという事実によって妨げられています。また、診断微生物学研究室は、自動化されたシステムを使用する必要があり、毎日、数百から数千に及ぶ多数の病原体を、、処理しなければなりません。ハイスループット日々の管理に加えて、細菌種の正確な同定が必要です。彼らは抗菌薬感受性パターンが異なるため、正確な同定は、適切な抗生物質を選択するための重要な情報（ 例えば、 エンテロコッカス属、 アシネトバクター属。）12,43を臨床医に提供するので、これが保証されています。 自動化された微生物同定システム（AMIS）細菌分離株の代謝特性を特徴づけるために酵素反応の標準化セットを適用<sup&gt; 13,15,16,26,27。これらのシステムで使用されるカートリッジが異なる生化学的反応、 例えば 、多数の利用がAMISのGNカード47は、この研究52で使用され、この戦略は、細菌のみの限定セットのための安全な同定を可能にします。さらに、データベース、高度なエキスパートシステムは、明らかに医学的に重要13,15,16,36の関連と関連性の高い細菌の検出に焦点を当てています。広く研究室で使用される2つの更なるシステムは、また、細菌同定のために、この生化学的手法を適用します。種が35を水平に3 回目のAMIのみ82.4パーセントの識別精度を持っていながら、最近の研究では、本研究で用いたAMISと競合他社の1（93.7パーセントと、それぞれ93.0パーセント）との間で同等の識別精度を実証します。このような差異は、基礎となる識別データの参照、キットおよびソフトウェア、メタボの違いのバージョンの品質によって説明することができますLISMと技術者35,36の習熟度。 二つの自動化されたMALDI-TOF MSシステム（MALDI-TOF微生物同定システム、MMIS）が主に使用されています。これらのシステムは、それらのタンパク質フィンガープリント質量スペクトルに基づいて、細菌種の多数の検出を可能にします。例えば、使用MMISのデータベースは、6000参照スペクトルが含まれています。質量分析に基づく識別システムは、まれな病原体11,48,51を含む微生物の多種多様の高速で信頼性の高い検出を提供しています。現在までにわずか数の直接比較は本研究で用いたMMISとその競争相手19,33の間にご利用いただけます。 Daek らによると、両方のシステムは、識別精度の同様の高い速度を提供するが、この研究で使用MMISは、種の同定19でより信頼性の高いと思われます。 同様に、分子技術はよく保存アドレッシングだけでなく、異なる遺伝子（ <em&gt;例えば、16S rDNAのかのrpoB）明確な種の同定3,22,61を可能にします。これらのうち、16SのrDNAのため、すべての細菌34におけるその存在の最も広く使用されているハウスキーピング遺伝子です。その機能は変化しないままで、最終的には、およそ1,500塩基対では、バイオインフォマティクス14,34のために適切であることが十分な長さです。多くの研究者が細菌同定21のための「ゴールドスタンダード」として16S rRNA遺伝子解析を考えています。これは、いくつかの研究室が稀または新しい細菌14,34を識別するためのこれまでに、DNA-DNAハイブリダイゼーション技術を使用するという事実によるものです。さらに、より多くのデータベースは、16S rRNA遺伝子の分析50のために使用することができる利用可能です。しかし、それは、16SのrDNAベースの検出システムは、標準的なPCRプロトコールと比較して制限された感度を有することを考慮しなければなりません。また、分子のアプローチは、同様に、時間がかかり洗練され、高度に訓練された人材を必要とします専用の研究施設とでは、そのため、簡単に診断ルーチン55に実装されていません。さらに、細菌の同定の少なくとも2つの異なる方法の組み合わせは非常に正確な株同定をもたらすことが示されています。 MALDI-TOF MS及び16SのrDNA配列の組み合わせは、高精度の異なる細菌種の多くの同定を可能にします。最近、MALDI-TOF MSおよび16S rRNA遺伝子解析の組み合わせは、疫学的な質問や珍しい病原体56を研究する細菌同定のために提示されました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>270733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser LT</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85600</td>
			<td>Oscillating Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-beads 1,0mm</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>412-2917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer 5436</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq PCR Core Kit (1000 U)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>201225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Forward Primer TPU1 (5&#180;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3&#8217;)</td>
			<td rowspan="2">biomers.net GmbH, Ulm, Germany&#160;</td>
			<td rowspan="2">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Reverse Primer RTU4 (5&#180;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&#180;)</td>
			<td rowspan="2">biomers.net GmbH, Ulm, Germany&#160;</td>
			<td rowspan="2">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Thermocylcer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube 1.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube 2 mL</td>
			<td>SARSTEDT, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,693,005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 8er-CapStrips</td>
			<td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td>711040X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 8er-SoftStrips</td>
			<td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td>711030X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp R-ZV11&#160;</td>
			<td>Sharp Electronics, Hamburg, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Microwave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1084211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td rowspan="2">Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td rowspan="2">849006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2 x 500 g)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartLadder SF - 100 to 1000 bp</td>
			<td>Eurogentec, L&#252;ttich, Belgium</td>
			<td>MW-1800-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (25 g)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF (10 g)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ComPhor L Maxi&#160;</td>
			<td>Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1&#160;%(10 mL)</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc 2000</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Gel-documentation system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT (500 reactions)</td>
			<td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom</td>
			<td>78201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer (10 x) with EDTA&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>402824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator Kit v1.1</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide (25 mL)</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyeEx 2.0 Spin Kit (250)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>63206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Sequenzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4306737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4317237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4317241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer, well plate septa</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4315933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4333466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Analysis Software 5.4</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microflex (the MALDI TOF MS maschine)</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system)</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>our mMIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITEK MS&#160;</td>
			<td>bioM&#233;rieux, N&#252;rtingen, Germany&#160;</td>
			<td></td>
			<td>2nd mMis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexControl 3.4 (control software)</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software)</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1&#160;g</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>201344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Calibration Standard II</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>222570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSP 96 target polished steel</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>8224989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqgreen&#160;</td>
			<td>peqlab&#160;</td>
			<td>37-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI Biotyper Galaxy&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td>
			<td>Part No. 1836007&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitek 2&#160;</td>
			<td>bioM&#233;rieux, N&#252;rtingen, Germany&#160;</td>
			<td></td>
			<td>our aMis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroScan&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td></td>
			<td>2nd aMis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Phoenix&#8482; Automated Microbiology System</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>3rd aMis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus&#160;subsp.&#160;aureus&#160;Rosenbach (ATCC&#174;&#160;25923&#8482;)</td>
			<td>ATCC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>postive control for PCR&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of rare bacterial pathogens by 16s rrna gene sequencing and maldi-tof ms

特に免疫不全患者で重篤な感染症を引き起こすことが報告されているため、十分に説明し、稀で、細菌性病原体の数があります。ほとんどの場合、ほとんどの症例報告として公開さわずか数のデータは、感染性病原体などの病原体の役割を調べるが利用可能です。したがって、そのような微生物の病原性の性質を明確にするためには、これらの細菌の多くを含む疫学的研究を行う必要があります。菌株の同定は、彼らが日常的診断において、（堅牢性）扱いやすい経済的でなければならない有効な命名法に従って正確である必要があり、それらは同等の生成する必要があります。このような調査研究で使用した方法は、以下の基準を満たさなければなりません異なる研究所間の結果。一般的に、ルーチンの設定で細菌株を識別するための3つの戦略があります。biochemicaを特徴付ける1）表現型の識別細菌のリットルと代謝特性、2）このような新規のプロ​​テオームベースのアプローチとして、16S rRNA遺伝子配列決定および3）質量分析などの分子技術。質量分析および分子的なアプローチは、細菌種の多種多様を同定するための最も有望なツールであるので、これらの2つの方法が記載されています。これらの技術を使用して進み、制限と潜在的な問題が議論されています。

MALDI-TOF MSは、新規、微生物学的診断ルーチンのための高速かつ安価な方法です。 MALDI-TOF MSによる細菌種の同定は、主に、リボソームタンパク質だけでなく、他の「環境条件によって最小限の程度に影響を受けたハウスキーピング機能を備えた非常に保存されたタンパク質」で構成されるスペクトルを生成し、このMMISの17【選択データベースは、参照スペクト...

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Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

The overall goal of this MALDI-TOF Mass Spectrometry protocol is to improve typing of rare pathogens through a rapid and cost-effective procedure. This method can help to answer key questions in the field of diagnostic microbiology, it allows rapid edification of rare bacterial pathogens. Today, we want to talk about odoratimimus and bacteria of the genus Myroides.To demonstrate the method and to talk about the interpretation of the results. Generally, individuals new to this method might find it difficult since transfer of bacteria, overlay with metrics, and interpretation of results require technical skills and microbiological expertise. We first had the idea to use MALD-TOF MS to screen for rare bacteria when we had a patient in our hospital suffering from a diabetic food infection caused by myroides odoratimus.Begin this protocol with the extraction of bacterial DNA, 16S ribosomal DNA PCR and Sanger sequencing as described in the text protocol. Use a wooden toothpick to transfer a single bacterial colony to a well of a 96 well steel target. Spot one microliter of 70%formic acid on top of the air-dried organism on the steel target, and leave to dry for approximately two to three minutes.Overlay the spot with one microliter of matrix solution containing 50 mg/ml of CHCA in an organic solvent composed of 50%acetonitrile, 2.5 trifluoroacetic acid, and 47.5%water. Let the smear and overlaid matrix air dry for about five minutes in a hood. To introduce the samples, aerate the sample loading port of the mass spectrometer by pressing the in/out button of the instrument.Open the loading port and insert the MALDI-TOF MS target plate with the dried bacterial smear plus matrix. Close the port and evacuate again. Observe the vacuum and when it reaches 4.5 million millibar start the measurement.Open the MMIS analysis software and click the file menu. Select New Classification"and a new window called MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard"should open. Type the project name in the field Project Name"and click New, under the new dialogue box named New Project, check the project name and proceed by clicking the Okay"button.In the MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard, observe the Analyte placement window. Select target positions, right click any selected position, and select Add samples. In the automatically opened table view, type in the sample name, sample ID, and optionally, a comment.Click the Next"button to proceed. Next, observe the selection of MALDI Biotyper methods window. Select Bruker Taxonomy"from the MSPs from Taxonomy Trees and click Next"to continue.Then, observe the project summary window. Check the inserted entries given above for the actual classification project. Start the classification run by clicking the Finish"button.Measurements start automatically when the appropriate vacuum is reached. Follow the classification run until the measurement is successfully completed. Once the measurement is complete, open the menu View"and click Results"to view the results table in the MALDI Biotyper Real Time Classification Project One.View the Bruker-Daltonik MALDI Biotyper classification results as an html file in the default web browser. Print and save the results. Shown here are spectra obtained by MALDI-TOF MS that are measured and classified in real time.The spectra are assigned a species name and a score value reflecting the quality of the measurement. Scores above 2.300 represent a highly-probable species identification. A score between 2.000 and 2.300 indicates a secure species identification.A score below 1.700 and 2.000 designates a probable species identification. And a score below 1.700 is non-reliable. The identification of bacterial pathogens grown on a pure culture on a solid medium takes two to three minutes.It is important to remember that rare bacteria pathogens can only be found with MALDI-TOF MS when the instruments reliably contains the appropriate spectra. Otherwise, it has to be expunged by integrating MaSDA spectra from typed strains of their characterized isolates. In the case where score results do not lead to an unequivocal strain identification, further methods, such as biochemical profiling or 16S rDNA sequencing can be applied.Though this method can provide insight into bacterial detection, it can also be applied to other microorganisms such as fungi or anaerobes. Furthermore, bacteria-resistance can be measured. Don't forget working with a matrix which is a hazardous substance, wear gloves, protective goggles, and work under a hood.Furthermore, it is absolutely necessary to dry the matrix and smear thoroughly to avoid splash overs in the analyzation chamber.

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