Name: indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland
Uploaded: 2015-12-01T14:00:00
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Gli autori sono grati per l&#39;impianto nucleo di imaging INRA MIMA2 (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) e al personale dell&#39;unità IERP (UE 0907, INRA, Jouy-en-Josas) per la cura degli animali e le strutture. Vorremmo anche ringraziare IH Mather, MC Neville e S. Tooze per averci fornito antibodie molto utile.

Topi CD1 sono stati allevati presso l&#39;INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Francia). Tutti gli aspetti etici della cura degli animali conformi alle relative linee guida ei requisiti di licenza stabiliti dal Ministero dell&#39;Agricoltura francese. Le procedure utilizzate sono state approvate dal comitato locale di etica (accordo 12/097 dal Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech). 1. ghiandola mammaria preparazione del campione <ol><li> Mouse ghiandola mammaria dissezione <ol><li>...

IHC è un metodo relativamente semplice e diretto sperimentale di localizzare l&#39;antigene in sezioni di tessuto, che dipende principalmente sulle specifiche interazioni epitopi-anticorpo. Anche se un gran numero di protocolli sono utilizzati per localizzare una proteina IIF, il nucleo di queste procedure è quasi sempre la stessa. Tuttavia, vi sono alcuni aspetti critici che possono influenzare fortemente il risultato e deve quindi essere ottimizzati per ciascuno studio individuale IHC. L&#39;aspetto più impegnativo...

La ghiandola mammaria è un atipico organo esocrina mammiferi la cui principale funzione è quella di produrre latte per nutrire i neonati. Lo sviluppo del tessuto mammario si verifica soprattutto dopo la nascita ed è caratterizzata da un processo unico in cui l&#39;epitelio invade lo stroma circostante. Questo tessuto subisce molti cambiamenti (crescita, differenziazione e regressione), soprattutto durante la vita adulta, in concomitanza con variazioni di stato riproduttivo (Figura 1). Oltre alla morfologia generale del tessuto, le proporzioni dei vari tipi di cellule, nonché la loro disposizione all&#39;interno della ghiandola mammaria cambiare radicalmente durante lo sviluppo 1-5. Durante la vita embrionale, l&#39;epitelio mammario deriva da linee latte mammarie, che è definita da un lieve ispessimento e stratificazione della ectoderma, tra gli arti anteriori e posteriori su ciascun lato della linea mediana intorno al giorno embrionale 10.5 (E10.5) (Figura 1A ).Sulla E11.5, la linea del latte scompone in singoli placodi, simmetricamente posizionati lungo la linea di latte mammaria in posizioni riproducibili, e il mesenchima circostante inizia a condensare. I placodi cominciano ad affondare più in profondità nel derma e mesenchima mammaria organizza a strati concentrici intorno al bocciolo mammaria (E12.5-E14.5). A partire dal E15.5, dell&#39;epitelio mammario, comincia a proliferare e allungare a formare il germoglio principale che spinge attraverso il mesenchima mammaria verso il cuscinetto adiposo. Il germoglio primario sviluppa un lume cavo con un&#39;apertura per la pelle, contrassegnata dalla formazione della guaina capezzolo. Sul E18.5, il condotto di allungamento è diventato il cuscinetto adiposo e si è ramificata in un piccolo sistema duttale arborized inglobato nel cuscinetto adiposo. Lo sviluppo è essenzialmente arrestato e la ghiandola mammaria rudimentale rimane morphogenetically quiescente fino alla pubertà. Nel embrione maschio, l&#39;attivazione dei recettori degli androgeni porta alla degenerazione dei germogli, che scompaionoda E15.5. Come di E18, sviluppo mammario cessa fino alla pubertà 6-9. Alla nascita, la ghiandola mammaria ospita un sistema duttale rudimentale che allunga e rami lentamente (una crescita isometrica). All&#39;inizio della pubertà, strutture sferiche situate alle estremità dei condotti chiamati gemme estremità terminale (TEBS), sono formate da uno strato esterno di cellule del cappuccio e un nucleo interno multistrato di cellule (cellule del corpo). Queste strutture sono altamente proliferative e infiltrano il tessuto stromale circostante in risposta a stimoli ormonali. La proliferazione all&#39;interno dei risultati TEBS in allungamento duttale, accoppiato con ramificazione morfogenesi. Questo processo porta alla creazione di una rete arborized epiteliale di base che emana dal capezzolo (Figura 1B, pubertà). A ~ 10-12 settimane dopo la nascita, quando l&#39;epitelio ha invaso tutto il cuscinetto di grasso, la sua espansione si arresta e il TEBS scomparire. Sviluppo duttale subisce quindi cambiamenti dinamici, vale a dire, successive la proliferazione e la regressione delle cellule epiteliali secondo cicli estrali 10 (Figura 1B, adulti). Dall&#39;inizio di gestazione, il tessuto mammario subisce importante crescita e cambiamenti morfologici per preparare l&#39;allattamento. L&#39;epitelio mammario ampiamente proliferano e differenziare, portando ad una ramificata rete altamente tubulo-alveolari. Allo stesso tempo, le cellule epiteliali mammarie (MECS) diventano polarizzata e in grado di sintetizzare e secernere prodotti lattiero-caseari. MECs organizzano in numerose strutture alveolari (acini), che sono circondati da cellule mioepiteliali contrattili e incorporati in uno stroma composta da tessuto connettivo e adiposo, vasi sanguigni e terminazioni nervose (Figura 1B, gravidanza). Inoltre, il lato basale MECs è in stretto contatto con la membrana basale (matrice extracellulare) e le interazioni tra queste due entità strettamente regolano sia la funzione morfogenesi e secretoria della mammellary epitelio 11-13. Tutti questi processi si basano sull&#39;azione di vari segnali ambientali, di cui i più importanti sono hormones14, fattori paracrini e la matrice extracellulare. Ad esempio, progesterone induce vasta ramificazione laterale 15 e alveologenesis che, in combinazione con prolattina (PRL) 16,17, promuove e mantiene la differenziazione degli alveoli. Oltre a steroidi e PRL18, citochine e vie di segnalazione associate allo sviluppo (Wnt e Notch vie di segnalazione) sono anche coinvolti nell&#39;impegno lignaggio mammaria e di sviluppo 19-21. Al termine della gravidanza, i MECs luminali iniziano a produrre un latte ricco di proteina nota come colostro nel lume degli alveoli. Inoltre, il progesterone agisce sulla permeabilità epiteliale e dato che le giunzioni strette sono ancora aperte, il colostro si trova anche nel sangue materno. Dopo il parto, il Mammary epitelio occupa quasi tutto il volume della ghiandola mammaria e è altamente organizzato (Figura 2, mammario). Unità latte produzione, ovvero alveoli (Figura 2, alveoli), sono formate da un monostrato di polarizzati mammarie epiteliali cellule secretorie (MESCs), con la loro membrana plasmatica apicale delimita il lume. Alveoli si dispongono in lobuli che sono raggruppati in lobi collegati a condotti che drenano il latte con l&#39;ambiente esterno (Figura 2, del lobo). Allattamento si verifica, ad esempio., MESCs iniziano a secernere abbondanti quantità di latte, innescato principalmente dal calo di ormoni della placenta (principalmente progesterone) (Figura 1B, allattamento). Geni delle proteine ​​del latte sono attivati ​​in un corso a tempo temporale definito che va dalla gravidanza al allattamento 9,22,23, soprattutto in risposta a ipofisaria PRL rilasciato al momento dell&#39;allattamento. Allo stesso tempo, i contatti tra MESCs e la matrice extracellulare, sia stimolano proteine ​​del latte syntESI attraverso i segnali che sono mediati attraverso le interazioni tra integrine e laminina 24,25 cellulari, e sopprimono l&#39;apoptosi in MESCs 26,27. Queste vie di segnalazione provocano l&#39;attivazione di proteine ​​del latte gene promoters 28 attraverso l&#39;attivazione della trascrizione specifici fattori di 29. Contatti cellula-cellula sono importanti anche per alcuni aspetti della differenziazione tra cui l&#39;istituzione della polarità apicale e la secrezione vettoriale di prodotti lattiero-caseari. Giunzioni strette rapidamente stretti dopo l&#39;inizio della lattazione e MESCs finemente orchestrano l&#39;assorbimento di molecole dal sangue così come la sintesi, il trasporto e la secrezione di componenti del latte, in risposta alle esigenze nutrizionali dei neonati. Al momento della suzione, la contrazione delle cellule mioepiteliali circondano gli alveoli si verifica in risposta a ossitocina e porta alla emissione del latte attraverso i condotti e nel capezzolo. Il latte è un liquido che contiene proteine ​​complessa (principalmentecaseine), zuccheri (principalmente lattosio), lipidi e minerali, come pure molecole bioattive come immunoglobuline A (IgA), fattori di crescita e ormoni. Sono sintetizzati caseine, assemblati in strutture supramolecolari, ossia micelle di caseina, trasportate lungo la via secretoria, e poi rilasciato per esocitosi, cioè, la fusione delle vescicole secretorie-caseina contenente (SV) con la membrana plasmatica apicale di MESC (Figura 2). Traffico intracellulare si basa su scambi materiali tra compartimenti membranose e coinvolge solubile N-ethylmaleimide sensibile Fusion (NSF) Allegato Protein (SNAP) Receptor (SNARE) 30,31. La famiglia delle proteine ​​SNARE è suddivisa in SNAREs vescicolari (v-lacci), presenti nella membrana della vescicola e SNAREs bersaglio (t-lacci), localizzati sulle membrane di destinazione. Con sfreccia tra loro domini coiled-coil, V e t-SNARE assemblare per formare un complesso altamente stabile fascio quattro elica, indicati come thcomplesso SNARE e. Questo complesso promuove la fusione di due doppi strati lipidici opposti gradualmente portarli in prossimità 30,32. In seguito, i complessi SNARE sono dissociate dalla adenosina trifosfatasi NSF e le sue proteine ​​adattatore Snap e SNARE proteine ​​sono riciclati di nuovo al loro compartimento di origine 33. È interessante notare che, ogni proteina SNARE risiede prevalentemente in compartimenti cellulari distinti e rullante accoppiamento possono contribuire alla specificità degli eventi di fusione intracellulari 34. Precedenti studi suggeriscono che almeno Protein 23 (SNAP23) e vescicole associata a membrana di proteine ​​8 (VAMP8), e sintaxine (Stx) sinaptosomiali associata -7 e -12 svolgono un ruolo nella caseina esocitosi 35,36. Queste proteine ​​sono state trovate anche in associazione con la frazione lipidica del latte, vale a dire, di grasso del latte (globuli MFGs) 37. Il modello prevalente corrente postula che gocce lipidiche citoplasmatici (CLD) sono formati dall&#39;accumulo di l neutroipids (soprattutto trigliceridi ed esteri di steroli) e colesterolo deriva dalla dieta materna tra i due volantini del reticolo endoplasmatico (ER) membrane 38-41. Grandi CLD si formano, almeno in parte, dalla fusione di CLD piccole mentre viene trasportato al lato apicale MESCs dove vengono rilasciati come MFGs (1-10 micron di diametro) per gemmazione, essendo avvolto dalla membrana plasmatica apicale MESC 40-42. Allattamento cessa dopo cuccioli sono svezzati e le MESCs progressivamente muoiono per apoptosi, che porta alla regressione del tessuto mammario a uno stato puberale (Figura 1B, involuzione). Immunofluorescenza (IF) è un metodo di laboratorio di analisi comune usato in quasi tutti gli aspetti della biologia, sia nella ricerca e nella diagnostica clinica. SE tecniche possono essere eseguite su sezioni di tessuto (immunoistochimica, IHC) o cellulari (immunocitochimica, ICC) campioni. Questo approccio potente si basa sull&#39;utilizzo di fluorescente-anticorpi marcati che specificamente si legano (direttamente o indirettamente) all&#39;antigene di interesse, permettendo così la visualizzazione della sua distribuzione tissutale tramite microscopia a fluorescenza. Segnali di fluorescenza per lo più dipendono dalla qualità e la concentrazione degli anticorpi e corretta manipolazione del campione. Un protocollo semplice immunofluorescenza indiretta (IIF) viene presentato per rilevare prodotti lattiero-caseari (caseine e MFGs) e proteine ​​coinvolte nella secrezione di prodotti lattiero-caseari (butirofilina (BTN1), rullante proteine) su sezioni congelate di tessuto mammario del mouse (Figura 3). Anche se questo protocollo offre una panoramica completa IHC, che vanno dalla raccolta di tessuto per l&#39;immagine dopo il trattamento, critica e passaggi facoltativi, nonché alcune raccomandazioni tecniche vengono anche presentati e discussi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dissection</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pins</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ethanol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Scissors</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel and adapted blades</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ice</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Towel paper</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tissue sample preparation</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td>
			<td style="width:155px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT compound/Tissue Tek</td>
			<td style="width:155px;">Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose (D-saccharose)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:155px;">Dominique Dutscher</td>
			<td>39910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cryostat/sample support</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Razor blades (SEC35)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>152200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Slide box</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>10143560W90/1014356190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Brushes</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IHC</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Permanent marker (black)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:239px;">50 mM NH4Cl in PBS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A-0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">0.1 M glycine in PBS</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>24403.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heater (up to 100&#176;C)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td>
			<td style="width:155px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000/H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>CORN2980-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nail polish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences 
			Center, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Biolegend (Covance)</td>
			<td>MMS-162P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-115-P0/P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:239px;">Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted S. Tooze 
			(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td>ab3348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-025-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counterstains</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bodipy 493/503</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Observation/Image capture</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">conventional fluorescence microscope</td>
			<td style="width:155px;">Leica Leitz DMRB 
			microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Standard filters for FITC, Rhodamine 
			and DAPI emissions,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&#710;F software (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss LSM 
			510 microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Plan-Apochromat &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CLSM 510 software,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Image treatment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.49k software</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td>Free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

L&#39;immunofluorescenza indiretta è utilizzato per rilevare e localizzare le proteine ​​di interesse in un tessuto. Il protocollo qui presentato descrive un metodo semplice e completo per la rilevazione di proteine ​​immunitario, mouse allattamento ghiandola mammaria essere preso come esempio. Un protocollo per la preparazione dei campioni di tessuto, soprattutto per quanto riguarda la dissezione del mouse di ghiandola mammaria, la fissazione dei tessuti e sezionamento tessuti congelati, sono dettagliati. Un protocollo standard per eseguire immunofluorescenza indiretta, tra cui un passo di recupero dell&#39;antigene opzionale, è anche presentato. L&#39;osservazione delle sezioni di tessuto etichettati così come l&#39;acquisizione di immagini e post-trattamenti sono anche indicati. Questa procedura fornisce una panoramica completa, dalla raccolta di tessuto animale per la localizzazione cellulare di una proteina. Anche se questo metodo generale può essere applicato ad altri campioni di tessuto, deve essere adattato ad ogni coppia anticorpo tessuto / primary studiato.

La ghiandola mammaria è una ghiandola sottocutanea situato lungo la struttura ventrale sia del torace e dell&#39;addome nei roditori. La posizione dei cinque coppie di ghiandole del mouse durante la gestazione è mostrata in Figura 4. La morfologia della ghiandola mammaria cambia drasticamente durante il suo sviluppo, riflettendo modifiche funzionali richieste per prepararsi alla piena lattazione (Figura 1B). Negli animali vergini o nullipare, la ghiandola...

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Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l&#39;immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini.

Immunofluorescenza indiretta su sezioni congelate di mouse ghiandola mammaria

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

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Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

Procedura di trapianto epiteliali mammarie

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Cambiamenti nella morfologia della ghiandola mammaria e rischio di cancro al seno in topi

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Valutazione dello Sviluppo ghiandola mammaria e funzione in modelli murini

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Iniezione intraduttale per Localizzato Drug Delivery per il mouse ghiandola mammaria

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

Effetto di Male Accessory Gland prodotti in deposizione delle uova in gasteropodi

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...