Name: indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland
Uploaded: 2015-12-01T14:00:00
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著者は、INRA MIMA2イメージングコア施設（INRA、UMR1198、ジュイ・アン・ジョザス）へと動物のケアと施設のIERPユニット（UE 0907、INRA、ジュイ・アン・ジョザス）のスタッフに感謝しています。我々はまた、非常に便利なantibodieをご提供するためのIHメイザー、MCネヴィルとS. Toozeに感謝したいと思います。

CD1マウスは、INRA（UE0907 IERP、ジュイ・アン・ジョザス、フランス）で飼育しました。動物のケアのすべての倫理的側面は、農業のフランスの省が定めた関連するガイドラインとライセンス要件を遵守。使用手順は、（Cometheaジュイ・アン・ジョザス/ AgroParisTechから契約12/097）ローカル倫理委員会によって承認されました。 1.乳腺サンプル調製<ol><li>マウス乳腺の?...

IHCは、特定のエピトープ - 抗体相互作用に主に依存する組織切片中の抗原をローカライズすることは比較的単純明快な実験方法です。プロトコルの多数IIFによってタンパク質を局在化するために使用されているが、これらの手順のコアは、ほとんど同じです。しかし、強く結果に影響を与えることができるため、各個人のIHC研究のために最適化されなければならないいくつかの重要な側面が...

乳腺は、その主な機能新生児を養うためにミルクを生産することである非定型哺乳類の外分泌器官です。乳房組織の開発は主に出生後に発生し、上皮が周囲の間質に侵入するユニークなプロセスによって特徴付けられます。この組織は、同時に生殖状態の変化（ 図1）で、特に大人の寿命の間に、多くの変更（増殖、分化および回帰）を受けます。組織の全体的な形態に加えて、異なる細胞型の割合だけでなく、乳腺内での配置が劇的に発展1-5中に変化します。 胚生活の間に、乳腺上皮は、胎生10.5（E10.5）（ 図1Aの周りの正中線の両側に前後と後肢の間、外胚葉のわずかな肥厚と層化によって定義されている乳房ミルクラインから派生）。E11.5で、ミルクラインが対称的に再現可能な場所で乳腺のミルクラインに沿って位置し、周囲の間充織が凝縮し始めている個々のプラコード、に分割します。プラコードは、真皮に深く沈み始め、乳腺間葉は乳腺芽（E12.5-E14.5）の周りに同心円状の層に編成されます。 E15.5の時点では、乳腺上皮は、増殖し、脂肪パッドに向けて乳腺間葉を通して押し出す主な芽を形成するために細長くを開始します。主な芽は乳首シースの形成によってマークされ、皮膚への開口部を有する中空内腔を、開発しています。 E18.5では、伸長ダクトは脂肪パッドに成長していると小さな樹状の管系に分岐した脂肪パッドに含まれます。開発は、基本的に逮捕され、基本的な乳腺は思春期までmorphogenetically静止のまま。男性の胚では、アンドロゲン受容体の活性化は消え芽の変性につながりますE15.5によって。 E18のように、乳房の発達は、思春期6-9まで停止します。 出生時に、乳腺はゆっくり伸びや枝初歩的な管系（アイソメトリック成長）を保有します。思春期の開始時に、ダクトの先端に位置する球状構造が末端芽（TEBS）が、キャップ細胞の外層と細胞の多層内部コア（体細胞）から形成されていると呼ばれます。これらの構造は非常に増殖性であり、ホルモンの合図に応答して、周囲の間質組織に潜入。乳管の伸長でTEBS結果内増殖は、分枝形態形成と相まって。このプロセスは、ニップル（ 図1B、思春期）から発せられる基本的な上皮樹状のネットワークの構築につながります。上皮が全体の脂肪パッドに侵入した時に生後〜10〜12週目に、その拡張は停止し、TEBSが消えます。乳管の開発は、動的変化、 すなわち 、successiを受けます発情周期10（ 図1B、成人）によると、上皮細胞の増殖と回帰しまし。 妊娠の発症から、乳房組織は、授乳の準備をするために重要な成長と形態学的変化を受けます。乳腺上皮は、広範囲に増殖し、分化する、高度に分岐した尿細管肺胞ネットワークにつながります。付随して、乳腺上皮細胞（のMEC）は、偏光と乳製品を合成し、分泌できるようになります。 MECは、収縮筋上皮細胞に囲まれており、結合および脂肪組織、血管や神経終末（ 図1B、妊娠）からなる間質に組み込まれている多数の肺胞構造（腺房）に整理します。さらに、のMECの基底側は基底膜（細胞外マトリックス）に密着しており、これら2つのエンティティ間の相互作用は、しっかりと乳房の両方の形態形成および分泌機能を調節しますRY上皮11-13。 これらのプロセスはすべて最も重要なのはhormones14、パラクリン因子や細胞外マトリックスであるの様々な環境手がかりの作用に依存しています。例えば、プロゲステロンは広範側分岐15を誘導し、そのalveologenesis、プロラクチン（PRL）16,17との組み合わせで、肺胞の分化を促進し、維持します。ステロイドとPRL18、サイトカインおよび開発に関連するシグナル伝達経路に加えて、（Wntおよびシグナル伝達経路ノッチ）も乳腺系譜コミットメントと開発19-21に関与しています。妊娠の終わりには、管腔のMECは、肺胞の内腔に初乳として知られるタンパク質が豊富な牛乳を生成し始めます。また、プロゲステロンは、上皮透過性に作用し、タイトジャンクショ​​ンがまだ開いているので、初乳はまた、母体血流中に見出されます。 分娩後、mammarY上皮は（ 図2、乳腺上皮）ほぼすべての乳腺ボリュームのアップかかり、高度に組織化されています。乳汁産生の単位、すなわち肺胞（ 図2、肺胞）は、それらの頂端細胞膜の内腔を画定して、偏乳房上皮分泌細胞（たmESC）の単層によって形成されます。肺胞は、外部環境（ 図2、葉）にミルクを排出ダクトに接続されたローブにグループ化されている小葉に自分自身を配置します。母乳は、発生すなわち 、たmESCは主に胎盤ホルモンの低下（主にプロゲステロン）（ 図1B、母乳）によってトリガミルクの豊富な量を分泌し始めます。乳タンパク質遺伝子は、主に授乳時に放出され、下垂体PRLに応答して、妊娠から授乳9,22,23の範囲で定義された一時的な時間経過で活性化されます。付随して、たmESCと細胞外マトリックス間の接触は、乳タンパク質SYNTを刺激両方携帯インテグリンおよびラミニン24,25の間の相互作用を介して媒介され、たmESC 26,27においてアポトーシスを抑制した信号を通じてhesis。これらのシグナル伝達経路は、特定の転写因子の活性化を介して29乳タンパク質遺伝子プロモーター28の活性化をもたらします。細胞間接触は、頂端の極性の確立と乳製品のベクトル分泌を含む分化のいくつかの側面のためにも重要です。授乳やたmESCの開始後速やかに近いタイトジャンクショ​​ンは細かく新生児の栄養要求に応じて、血液からの分子の取り込みだけでなく、乳成分の合成、輸送および分泌を調整。授乳時には、肺胞を取り巻く筋上皮細胞の収縮は、オキシトシンに反応して発生し、ダクトを通って乳首に射乳につながります。ミルクはタンパク質を含む複雑な流体（主にありますカゼイン）、糖（主に乳糖）、脂質、ミネラル、ならびにそのような免疫グロブリンA（IgAの）、成長因子およびホルモンなどの生理活性分子。カゼイン、すなわち分泌経路に沿って搬送ミセル、カゼイン、超分子構造に組み立てられ、合成され、その後、エキソサイトーシスにより放出され、すなわち 、MESCの頂端細胞膜でのカゼイン含有分泌小胞の融合（のSV）（ 図2）。 細胞内のトラフィックは、膜状の区画間の材料の交換に依存しており、可溶性N-エチルマレイミド感受性融合（NSF）付着タンパク質（SNAP）受容体（SNARE）30,31を含んでいます。 SNAREタンパク質ファミリーは、ターゲット膜に局在水疱性小胞膜内に存在するのSNARE（V-のSNARE）、および目標のSNARE（T-のSNARE）に細分されます。それらのコイルドコイルドメイン、VおよびTのSNAREは非常に安定な4ヘリックス束複合体を形成するために組み立てを通してジッピングによって、目と称される電子スネア複合体。この複合体は徐々に近接30,32にそれらをもたらすことによって、2つの対向する脂質二重層の融合を促進します。その後、SNARE複合体は、NSFアデノシン三リン酸によって解離され、そのアダプタータンパク質SNAPおよびSNAREタンパク質は、起源33のその区画に戻して再利用されています。興味深いことに、各SNAREタンパク質は、主に個別の細胞区画内に存在し、SNAREのペアリングは、細胞内の融合事象34の特異性に寄与することができます。以前の研究では、少なくともタンパク質23（SNAP23）および小胞関連膜タンパク質8（VAMP8）、およびシンタキシン（のStx）のシナプトソームが関連することを示唆している-7および-12カゼインエキソサイトーシス35,36における役割を果たしています。これらのタンパク質はまた、乳の脂質画分、 すなわち 、乳脂肪球（MFGs）37に関連して発見されています。現在の支配的なモデルは、細胞質脂質滴（CLDs）は中立リットルの蓄積によって形成されていることを仮定しますipids（主にトリアシルグリセロールおよびステロールエステル）および小胞体（ER）膜38〜41の2リーフレットの間の母体の食事由来のコレステロール。彼らは（直径1〜10ミクロン）MFGsとしてリリースされたmESCの頂端側に輸送されながら大CLDsはMESC頂端形質膜によって包まれて、出芽によって少なくとも部分的には、小さいCLDsの融合によって形成され、 40-42。子犬が乳離れした後に授乳を停止し、たmESCは徐々にアポトーシスによって死ぬ、バック思春期状態（ 図1B、退縮）に乳房組織の回帰につながります。 免疫蛍光（IF）は、研究および臨床診断の両方で、生物学のほぼすべての面で使用される一般的な分析実験室の方法です。技術は、組織切片（免疫組織化学、IHC）または細胞（免疫細胞化学、ICC）のサンプル上で行うことができます。この強力なアプローチはfluorescent-の使用に依存しています具体的にはこのようにして、蛍光顕微鏡を通じて組織分布の可視化を可能にする、目的の抗原に（直接または間接的に）結合する標識された抗体。蛍光シグナルは、主に品質や濃度の抗体と試料の適切な処理に依存します。単純な間接免疫蛍光（IIF）プロトコルは、乳製品（カゼインとMFGs）およびマウス乳房組織（ 図3）の凍結切片上の乳製品分泌（butyrophilin（BTN1）、SNAREタンパク質）に関与するタンパク質を検出するために提示されます。このプロトコルは、組織採取から画像後処理、クリティカルおよびオプションのステップだけでなく、いくつかの技術的な勧告に至るまで、完全なIHCの概要を提供していますが、また提示し、議論されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dissection</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pins</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ethanol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Scissors</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel and adapted blades</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ice</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Towel paper</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tissue sample preparation</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td>
			<td style="width:155px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT compound/Tissue Tek</td>
			<td style="width:155px;">Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose (D-saccharose)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:155px;">Dominique Dutscher</td>
			<td>39910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cryostat/sample support</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Razor blades (SEC35)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>152200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Slide box</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>10143560W90/1014356190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Brushes</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IHC</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Permanent marker (black)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:239px;">50 mM NH4Cl in PBS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A-0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">0.1 M glycine in PBS</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>24403.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heater (up to 100&#176;C)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td>
			<td style="width:155px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000/H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>CORN2980-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nail polish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences 
			Center, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Biolegend (Covance)</td>
			<td>MMS-162P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-115-P0/P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:239px;">Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted S. Tooze 
			(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td>ab3348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-025-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counterstains</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bodipy 493/503</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Observation/Image capture</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">conventional fluorescence microscope</td>
			<td style="width:155px;">Leica Leitz DMRB 
			microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Standard filters for FITC, Rhodamine 
			and DAPI emissions,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&#710;F software (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss LSM 
			510 microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Plan-Apochromat &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CLSM 510 software,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Image treatment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.49k software</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td>Free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

間接免疫蛍光を検出し、組織中の目的のタンパク質を特定するために使用されます。ここに提示されたプロトコルは、タンパク質の免疫検出のために完全かつ簡単な方法は、乳腺泌乳マウスを例に説明しています。特にマウス乳腺腺、組織固定および凍結組織切片の解剖に関する組織サンプルの調製のためのプロトコールは、詳述されています。標準プロトコルは、任意の抗原回復工程を含む、間接免疫蛍光法を実行することも示されています。ラベルされた組織切片の観察と同様に、画像取得および後処理も記載されています。この手順は、動物組織のコレクションからのタンパク質の細胞内局在に、完全な概要を説明します。この一般的な方法は、他の組織サンプルに適用することができるが、それは、試験した各組織/一次抗体に結合するように適合されるべきです。

乳腺は胸部やげっ歯類における腹部の両方の腹側構造に沿って配置された皮下腺です。妊娠中のマウスの腺の5組の位置は、図4に示されている。乳腺の形態が劇的に完全授乳（ 図1B）の準備をするために必要な機能の変更を反映し、その開発中に変化します。バージンまたは未経産の動物では、乳腺が見えにくいかもしれ薄い脂肪間質内に埋め込まれた疎分...

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Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

この資料に記載されている間接免疫プロトコルは、検出およびマウス乳腺中のタンパク質の局在を可能にします。完全な方法は、乳腺のサンプルを調製するために蛍光顕微鏡により画像を、組織切片の免疫組織化学を実行し、画像を再構成するために与えられています。

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Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

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Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

腹足類軟体動物に産卵に男性付属腺製品の効果

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...