Name: indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland
Uploaded: 2015-12-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Авторы благодарны основной изображений объекта ИНРА MIMA2 (INRA, UMR1198, Жуи-ан-Жоза) и сотрудникам аппарата IERP (UE 0907, ИНРА, Жуи-ан-Жоза) для ухода за животными и удобствам. Мы хотели бы также поблагодарить IH Mather, MC Невилл и С. Туз за предоставление нам очень полезную antibodie.

Мышей CD1 были выведены на INRA (UE0907 IERP, Жуи-ан-Жоза, Франция). Все этические аспекты ухода за животными соблюдены соответствующих руководящих принципов и требований лицензирования, установленными французского министерства сельского хозяйства. Процедуры, используемые были утверждены мес...

IHC является относительно простой и прямой экспериментальный метод локализации антигена в срезах тканей, которые в первую очередь зависит специфический эпитоп-антитело взаимодействий. Хотя большое количество протоколов используются для локализации белка на IIF, сердечник из этих проц?...

Молочная железа является нетипичным млекопитающих экзокринной орган, основной функцией которого является производство молока, чтобы кормить новорожденных. Развитие ткани молочной железы происходит главным образом после родов и характеризуется уникального процесса, в котором эпителий вторжению в окружающую строму. Эта ткань подвергается много изменений (рост, дифференцировку и регрессия), особенно во время взрослой жизни, одновременно с изменениями в репродуктивного статуса (рисунок 1). В дополнение к общей морфологии ткани, пропорции различных типов клеток, а также их расположение в молочной железе резко изменяются в течение развития 1-5. Во время эмбрионального жизни, молочной эпителия происходит от молочных линий молоко, которое определяется небольшим утолщением и стратификации эктодермы, между передними и задними конечностями с каждой стороны от средней линии вокруг эмбрионального день 10,5 (E10.5) (рис 1А ).На E11.5, молокопровод распадается на отдельные плакодах, которые симметрично расположены вдоль линии молочной молоко воспроизводимых местах, и окружающие мезенхимы начинает конденсироваться. Плакод начинают все глубже в дерму и молочной мезенхимы организует в концентрических слоев вокруг молочной зародыше (E12.5-E14.5). По E15.5, молочной эпителий, начинает размножаться и удлиненные, чтобы сформировать первичную росток, который толкает через молочной мезенхимы к жировой ткани. Основной росток развивает полый просвет с отверстием для кожи, отмеченной формирования соска оболочки. На E18.5, то удлиняя канал превратился в жировой ткани и имеет разветвленную в небольшой arborized системы протоков охватила в жировой ткани. Разработка, по существу, арестован и в зачаточном состоянии молочной железы остается морфогенетически покоя до наступления половой зрелости. В мужской эмбрион, активация рецепторов андрогенов приводит к дегенерации почек, которые исчезаютпо E15.5. По E18, молочной развития не перестает до полового созревания 6-9. При рождении, молочной железы таит в себе элементарное систему протоков, что продлевает и филиалы медленно (изометрической роста). В начале полового созревания, сферические структуры, расположенные на кончиках протоков называют концевой почки (TEBS), образуются из внешнего слоя клеток рака простаты и многослойной внутреннего ядра клеток (клеток тела). Эти структуры являются весьма пролиферативного и проникнуть в окружающую ткань стромы в ответ на гормональные сигналы. Распространение в результатах TEBS в протоковой удлинения, в сочетании с морфогенеза ветвления. Этот процесс приводит к созданию основного эпителиального arborized сети, исходящей из соска (рис 1B, период полового созревания). В ~ 10-12 недель после рождения, когда эпителий вторглись весь жировой ткани, ее расширение прекращается и TEBS исчезают. Развитие протоков затем подвергается динамические изменения, т.е. успехуве пролиферацию и регресс эпителиальных клеток в соответствии с эстрального цикла 10 (Рис 1В, взрослых). С самого начала беременности, молочной ткани подвергается существенный рост и морфологические изменения, чтобы подготовиться к лактации. Молочная эпителия интенсивно пролиферируют и дифференцируются, что ведет к сильно разветвленного тубуло-альвеолярного сети. Одновременно, эпителиальных клеток молочной железы (МИК) поляризованы и способны синтезировать и секретировать молочные продукты. МИК организовать в многочисленных альвеолярных структур (ацинусов), которые окружены сократительных клеток миоэпителиальных и включены в строме, состоящей из соединительной ткани и жировой, кровеносных сосудов и нервных окончаний (Фигура 1В, беременность). Кроме того, базальные сторона MECs находится в тесном контакте с базальной мембраной (внеклеточного матрикса), и взаимодействие между этими двумя организациями плотно регулировать как морфогенез и секреторную функцию молочной железыры эпителий 11-13. Все эти процессы опираются на действия различных экологических киев, из которых наиболее важными являются hormones14, паракринных факторов и внеклеточного матрикса. Например, прогестерон вызывает обширный боковой ветвления 15 и alveologenesis, что, в сочетании с пролактина (PRL) 16,17, продвигает и поддерживает дифференцировку альвеол. В дополнение к стероидам и PRL18, цитокинов и сигнальных путей, связанных с развитием (Wnt и Notch сигнальными путями) также участвуют в молочной приверженности клонов и развития 19-21. В конце беременности, просвета МИК начинают производить богатой белком молока, известный как молозиво в просвете альвеол. Кроме того, прогестерон действует на эпителиальной проницаемости и так как плотные соединения остаются открытыми, молозиво также в материнском кровотоке. После родов, то Mammarу эпителий занимает почти всю молочную железу и объема имеет высокую степень организации (рисунок 2, эпителия молочной железы). Молоко производящих единиц, а именно альвеолы ​​(Рисунок 2, альвеолы), формируются монослоя поляризованных эпителиальных молочных секреторных клеток (MESCs), с их апикальной плазматической мембраны разграничения просвет. Альвеолы ​​организовать себя на дольки, которые сгруппированы в долях, связанных с каналами, которые истощают молоко с внешним среде (рис 2, доли). Лактации происходит, т.е.., MESCs начинают секретировать обильные количества молока, в первую очередь вызвано снижением плацентарных гормонов (главным образом прогестерон) (фиг.1В, лактации). Гены молочного белка активируются в определенном временном время хода в диапазоне от беременности лактации 9,22,23, главным образом, в ответ на PRL гипофиза, опубликованном в момент кормления грудью. Одновременно, контакты между MESCs и внеклеточного матрикса как стимулировать молочный белок SYNThesis через сигналы, которые передаются через взаимодействий между клеточными интегринов и ламинином 24,25, подавляющих апоптоз и в MESCs 26,27. Эти сигнальные пути приводит к активации молочного белка промоторов генов 28 через активацию факторов транскрипции конкретного 29. Межклеточных контактов также важны для некоторых аспектов дифференцировки, включая создание верхушечного полярности и векторной секреции молочных продуктов. Плотные соединения быстро закрыть после начала лактации и MESCs мелко организовать поглощение молекул из крови, а также синтеза, транспорта и секреции молочных компонентов, в ответ на потребности в питании новорожденных. Во время сосания, сокращение миоэпителиальных клеток, окружающих альвеолы ​​происходит в ответ на окситоцина и приводит к выделению молока по протокам и в соске. Молоко представляет собой сложную жидкость, которая содержит белки (в основномказеин), сахара (в основном лактозы), липиды и минеральные вещества, а также биологически активные молекулы, такие как иммуноглобулины (IgA), факторов роста и гормонов. Казеины синтезируются, собраны в супрамолекулярных структур, а именно казеин мицеллы, транспортируемые вдоль секреторного пути, а затем выпущен экзоцитоза, то есть сплав казеина, содержащего секреторные везикулы (КА) с апикальной мембране мЭСК (рисунок 2). Внутриклеточного транспорта зависит от материальных обменов между мембранных отсеков и включает в себя Растворимый N-этилмалеимид-Чувствительный Fusion (NSF) Приложение белка (SNAP) рецепторов (SNARE) 30,31. Семья SNARE белки подразделяется на везикулярного SNAREs (V-ловушки), присутствующих в мембране везикул и целевых SNAREs (т-ловушки), локализованные на целевых мембран. По сжать через их биспиральных доменов, V и Т-SNAREs собрать с образованием высокостабильный четыре спиралей комплекс, называют йе SNARE комплекс. Этот комплекс способствует сочетание двух противоположных липидного бислоя постепенно привести их в непосредственной близости 30,32. Впоследствии, Малый комплексы диссоциируют на NSF аденозинтрифосфатазы и его адаптер белка SNAP и малого белки возвращают обратно в купе происхождения 33. Интересно, что каждый белок SNARE преимущественно проживает в различных клеточных отсеках и малого спаривания может внести свой ​​вклад в специфичность внутриклеточных событий термоядерных 34. Предыдущие исследования показывают, что, по крайней мере Синаптосомальное-ассоциированный белок 23 (SNAP23) и везикул-ассоциированный мембранный белок 8 (VAMP8) и syntaxins (STX) -7 -12 и играют важную роль в казеина экзоцитоза 35,36. Эти белки были также обнаружены в ассоциации с липидной фракции молока, т.е. молоко жировых шариков (МФГС) 37. В настоящее время преобладает модель постулирует, что цитоплазматические капли липидов (CLDs) образуются в результате накопления нейтральной лipids (главным образом триглицериды и эфиры стеринов) и холестерин, полученный от материнской диете между двумя листовок эндоплазматическая сеть (ЭР) мембраны 38-41. Большие CLDs формируются, по крайней мере частично, путем слияния меньших CLDs во время транспортировки в апикальной стороне MESCs где они будут освобождены, как MFGS (1-10 мкм в диаметре) почкованием, будучи enwrapped по MESC апикальной мембране 40-42. Кормление грудью прекращается через щенки отнимают и MESCs постепенно умирают путем апоптоза, что приводит к регрессии ткани молочной железы обратно в пубертатном состоянии (рис 1B, инволюция). Иммунофлуоресценции (ИФ) является общим аналитическая лаборатория метод используется практически во всех аспектах биологии, и в научных исследованиях и в клинической диагностике. Если методы могут быть выполнены на срезах тканей (иммуногистохимия, IHC) или (иммуноцитохимия, ICC) Образцы клеток. Этот мощный подход основан на использовании fluorescent-меченые антитела, которые специфически связываются (прямо или косвенно) к интересующему антигену, таким образом позволяя визуализацию его распределение в тканях через флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентных сигналов во многом зависит от качества и концентрации антител и надлежащей обработки образца. Простой непрямой иммунофлюоресценции (IIF) протокол представлен для обнаружения молочные продукты (казеин и МФГС) и белков, участвующих в секреции молочных продуктов (butyrophilin (btn1), Малый белки) на замороженных участках молочной железы мыши ткани (рисунок 3). Хотя этот протокол обеспечивает полный обзор IHC, начиная от сбора ткани для изображения после лечения, важно и дополнительных шагов, а также некоторых технических рекомендаций также представлены и обсуждены.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dissection</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pins</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ethanol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Scissors</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel and adapted blades</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ice</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Towel paper</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tissue sample preparation</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td>
			<td style="width:155px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT compound/Tissue Tek</td>
			<td style="width:155px;">Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose (D-saccharose)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:155px;">Dominique Dutscher</td>
			<td>39910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cryostat/sample support</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Razor blades (SEC35)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>152200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Slide box</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>10143560W90/1014356190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Brushes</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IHC</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Permanent marker (black)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:239px;">50 mM NH4Cl in PBS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A-0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">0.1 M glycine in PBS</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>24403.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heater (up to 100&#176;C)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td>
			<td style="width:155px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000/H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>CORN2980-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nail polish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences 
			Center, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Biolegend (Covance)</td>
			<td>MMS-162P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-115-P0/P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:239px;">Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted S. Tooze 
			(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td>ab3348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-025-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counterstains</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bodipy 493/503</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Observation/Image capture</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">conventional fluorescence microscope</td>
			<td style="width:155px;">Leica Leitz DMRB 
			microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Standard filters for FITC, Rhodamine 
			and DAPI emissions,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&#710;F software (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss LSM 
			510 microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Plan-Apochromat &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CLSM 510 software,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Image treatment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.49k software</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td>Free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

Непрямой иммунофлуоресценции используется для обнаружения и определения местоположения интерес белков в ткани. Протокол, представленные здесь описывает полное и простой способ для иммунной обнаружения белков, мышь лактирующих молочную железу, принимаемых в качестве примера. Протокол для подготовки образцов ткани, особенно в отношении рассечение молочной железы мыши, ткани фиксации и замороженной ткани срезов, подробно. Стандартный протокол для выполнения непрямой иммунофлюоресценции, в том числе дополнительного шага поиска антигена, также представлены. Наблюдение меченых срезов, а также получение изображений и пост-обработки также заявил. Эта процедура дает полный обзор, из коллекции тканей животных в клеточной локализации белка. Хотя это общий способ может быть применен к другим образцов ткани, она должна быть приспособлена к каждой ткани / первичным антителом пару изучены.

Молочная железа является подкожная железа, расположенная вдоль вентральной структуры как грудной клетки и брюшной полости у грызунов. Расположение пяти пар желез мыши во время беременности показано на рисунке 4. Морфология молочной железы резко меняется в своем разви?...

Watch this Scientific Journal Video about Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Косвенным протокол иммунофлюоресценции описано в этой статье позволяет обнаруживать и локализовать белков в молочной железе мыши. Полный метод ее подготовки молочных желез образцы, для выполнения иммуногистохимии, чтобы изображение на срезах тканей с помощью флуоресцентной микроскопии, и, чтобы восстановить изображение.

Непрямой иммунофлюоресценции на замороженные Разделы молочной железы мыши

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

indirect-immunofluorescence-on-frozen-sections-of-mouse-mammary-gland

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Иммуногистохимии на парафиновых срезах Мыши Эпидермис Использование флуоресцентных антител

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Мышь эпителиальных клеток молочной форме Mammospheres Во лактогенный Дифференциация

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Изменения в молочной железы Морфология и риск рака молочной железы у крыс

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Парафин и замороженные Разделы Drosophila Мышцы взрослых

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Выделение мышью слюнных желез стволовых клеток

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Оценка молочной железы развития и функции в моделях мыши

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Single Cell транскрипции Профилирование взрослых кардиомиоцитов мышь

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Внутрипротоковый впрыска для локализованной доставки лекарств к молочной железы мыши

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Влияние Мужской аксессуар железы Продукты на откладки яиц в брюхоногих моллюсков

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Изоляция нетронутыми, весь мыши молочных желез для анализа выражения внеклеточного матрикса и морфология железы

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...