Name: indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland
Uploaded: 2015-12-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Författarna är tacksamma mot INRA MIMA2 imaging core facility (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) och personalen på IERP enheten (UE 0907, INRA, Jouy-en-Josas) för djuromsorg och anläggningar. Vi vill också tacka IH Mather, MC Neville och S. Tooze för att förse oss med mycket användbar antibodie.

CD1 möss avlades vid INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Frankrike). Alla etiska aspekter på djurvård uppfyllde de relevanta riktlinjer och licenskrav som fastställts av franska jordbruksministeriet. De metoder som används godkändes av den lokala etiska kommittén (överenskommelse 12/097 från Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech). 1. bröstkörtel Provberedning <ol><li> Mouse bröstkörtel dissektion <ol><li> Euthanize möss vid dag 10 av amning genom halsdislokation och s...

IHC är en relativt enkel och okomplicerad experimentell metod för att lokalisera antigen i vävnadssnitt, som beror främst på specifika epitop-antikropp interaktioner. Även om ett stort antal protokoll används för att lokalisera ett protein genom IIF, är kärnan i dessa förfaranden nästan alltid densamma. Det finns dock några viktiga aspekter som starkt kan påverka resultatet och därför måste optimeras för varje enskild IHC studie. Den svåraste aspekten av detta tillvägagångssätt är att fastställa ...

Bröstkörteln är en atypisk däggdjurs exokrin organ vars huvudsakliga funktion är att producera mjölk för att föda nyfödda. Utvecklingen av bröstvävnad sker främst efter födseln och kännetecknas av en unik process där epitel invaderar omgivande stroma. Denna vävnad genomgår många förändringar (tillväxt, differentiering och regressions), särskilt under vuxenlivet, samtidigt med variationer i reproduktiv status (Figur 1). Förutom den övergripande morfologin hos vävnaden, proportionerna av olika celltyper samt deras arrangemang inom bröstkörteln förändras dramatiskt under utvecklingen 1-5. Under embryolivet, härleder bröst epitel från bröstmjölkledningarna, vilket definieras av en liten förtjockning och skiktning av ektoderm, mellan de främre och bakbenen på var sida om mittlinjen runt embryodag 10,5 (E10.5) (Figur 1A ).På E11.5, bryter mjölkledningen upp i enskilda placodes, vilka är symmetriskt placerade utmed bröstmjölkledningen vid reproducerbara platser, och den omgivande mesenkym börjar kondensera. De placodes börjar sjunka djupare in i huden och bröst mesenkymet organiserar i koncentriska lager runt bröst knopp (E12.5-E14.5). Som av E15.5, bröst epitel, börjar att föröka sig och förlänga för att bilda den primära gro som driver genom bröst mesenkymet mot fettkudden. Den primära grodd utvecklar en ihålig lumen med en öppning på huden, präglad av bildningen av nippeln manteln. På E18.5, har förlängning kanalen vuxit till fettkudden och har grenade i en liten arborized gångsystemet omfattas i fettkudden. Utvecklingen i huvudsak arresteras och rudimentära bröstkörteln fortfarande morphogenetically vilande fram till puberteten. I den manliga embryot, aktiveringen av androgenreceptorer leder till degeneration av knopparna, som försvinnergenom E15.5. Från och med E18, upphör bröst utveckling fram till puberteten 6-9. Vid födseln, hamnar bröstkörteln en rudimentär gångsystemet som förlänger och grenar långsamt (isometrisk tillväxt). Vid början av puberteten, sfäriska strukturer belägna vid spetsarna av kanalerna som kallas den terminala änden knoppar (TEBS), är bildade av ett yttre skikt av cap-celler och en flerskiktad inre kärna av celler (kroppsceller). Dessa strukturer är mycket proliferativ och infiltrera omgivande stromal vävnad som svar på hormonella signaler. Spridning inom TEBS resulterar i duktal töjning, i kombination med förgrening morfogenes. Denna process leder till upprättandet av en grundläggande epitel arborized nätverk som härrör från bröstvårtan (Figur 1B, puberteten). Vid ~ 10-12 veckor efter födseln, när epitelet har invaderat hela fettkudden, stoppar sin expansion och TEBS försvinna. Ductal utveckling genomgår sedan dynamiska förändringar, det vill säga, successive spridning och regression av epitelceller enligt estruscyklerna 10 (Figur 1B, vuxen). Från starten av dräktigheten undergår bröstvävnad viktig tillväxt och morfologiska förändringar för att förbereda för amning. Bröst epitel utför proliferera och differentiera, vilket leder till en i hög grad grenad tubulo-alveolära nätverk. Samtidigt, bröstepitelceller (MECS) blir polariserad och kunna syntetisera och utsöndra mjölkprodukter. MEC organisera sig i ett stort antal alveolära strukturer (acini) som är omgivna av kontraktila myoepitelceller och ingår i en stroma består av bindväv och fettvävnad, blodkärl och nervterminaler (Figur 1B, graviditet). Dessutom är den basala sidan av MEC i nära kontakt med basalmembranet (extracellulär matrix), och samspelet mellan dessa två enheter tätt reglera både morfogenes och sekretoriska funktion av mammary epitel 11-13. Alla dessa processer är beroende av verkan av olika miljö ledtrådar, varav de viktigaste är hormones14, parakrina faktorer och den extracellulära matrisen. Exempelvis inducerar progesteron omfattande sido förgrening 15 och alveologenesis som i kombination med prolaktin (PRL) 16,17, främjar och upprätthåller differentiering av alveolerna. Förutom steroider och PRL18, cytokiner och signalvägar i samband med utveckling (Wnt och Notch signalvägar) är också involverade i bröst härstamning engagemang och utveckling 19-21. Vid slutet av graviditeten, de luminala MEC börja producera en proteinrik mjölk kallas råmjölk i lumen i alveolerna. Dessutom fungerar progesteron på epiteliala permeabiliteten och eftersom tight junctions fortfarande är öppna, är kolostrum också i det maternella blodet. Efter förlossning, den mammary epitel tar upp nästan hela bröstkörteln volym och mycket organiserad (Figur 2, bröst epitel). Mjölkproducerande enheter, nämligen alveolerna (Figur 2, alveol), är bildade av ett monoskikt av polariserade bröstepitelialceller sekretoriska celler (MESCs), med deras apikala plasmamembranet som avgränsar hålrummet. Alveoler ordna sig i lobules som är grupperade i lober anslutna till ledningar som dränerar mjölk på utsidan miljö (Figur 2, lob). Amning uppstår, dvs., MESCs börjar utsöndra rikliga mängder mjölk, främst utlöses av nedgången i moderkakan hormoner (främst progesteron) (Figur 1B, laktation). Mjölkprotein gener aktiveras i en bestämd tids tidsförloppet sträcker sig från graviditet till amning 9,22,23, främst till följd av hypofysen PRL släpptes vid tidpunkten för diande. Samtidigt, kontakterna mellan MESCs och den extracellulära matrisen både stimulera mjölkprotein synthesis genom signaler som medieras via interaktioner mellan cellulära integriner och laminin 24,25, och undertrycker apoptos i MESCs 26,27. Dessa signalvägar resulterar i aktivering av mjölkprotein genpromotorer 28 genom aktivering av specifika transkriptionsfaktorer 29. Cell-cellkontakter är också viktiga för vissa aspekter av differentiering, inklusive fastställandet av apikala polaritet och vektor utsöndringen av mjölkprodukter. Tight junctions snabbt nära efter början av laktationen och MESCs iscensätta fint upptaget av molekyler från blodet samt syntes, transport och utsöndring av mjölkkomponenter, som svar på de näringsbehov nyfödda. Vid tidpunkten för diande, sammandragning av myoepitelceller omger alveolerna sker som svar på oxytocin och leder till mjölkutdrivning genom ledningarna och in i nippeln. Mjölk är en komplex fluid som innehåller proteiner (mestadelskaseiner), sockerarter (huvudsakligen laktos), lipider och mineraler, samt bioaktiva molekyler såsom immunoglobuliner A (IgA), tillväxtfaktorer och hormoner. Kasein syntetiseras, samlade i supramolekylära strukturer, nämligen kaseinmiceller, transporteras längs den sekretoriska vägen, och sedan släpptes av exocytos, dvs fusion av kasein innehållande sekretoriska vesiklar (SVS) med apikala plasmamembranet hos Mesc (Figur 2). Intracellulär trafiken bygger på materialutbyte mellan membran fack och innebär Lösliga N-etylmaleimid-Sensitive Fusion (NSF) Attachment Protein (SNAP) Receptor (SNARE) 30,31. Snaran proteiner familj är uppdelad i vesikulära Snares (V-snaror), som föreligger i vesikelmembranet, och målgrupp snaror (t-snaror), lokaliserade på rikt membranen. Genom zippa genom deras coiled-coil-domäner, V- och t-snaror samlas för att bilda en mycket stabil fyra-helixknippet komplex, kallad ee SNARE komplexet. Detta komplex främjar fusion av två motstående lipiddubbelskikt genom att gradvis föra dem i omedelbar närhet 30,32. Efteråt är SNARE-komplex dissocieras av NSF adenosintrifosfatas och dess adapter protein SNAP och SNARE proteinerna återförs till sin -delområde 33. Intressant, bosatt varje SNARE protein, främst olika cellulära fack och SNARE parning kan bidra till specificiteten av intracellulära fusion händelser 34. Tidigare studier tyder på att åtminstone Synaptosomal associerat protein 23 (SNAP23) och Vesikel-associerad membranprotein 8 (VAMP8), och syntaxins (STX) -7 och -12 spela en roll i kasein exocytos 35,36. Dessa proteiner har också påträffats i association med lipiden fraktionen av mjölk, dvs mjölk fettkulor (MFGs) 37. Den nuvarande rådande modellen förutsätter att cytoplasmiska lipiddropparna (CLDs) bildas genom ackumulering av neutrala lipids (främst triacylglyceroler och sterolestrar) och kolesterol härrör från moderns kost mellan de två bladen av endoplasmanätet (ER) membran 38-41. Stora CLDs bildas, åtminstone delvis, genom fusion av mindre CLDs under transport till den apikala sidan av MESCs där de släpps som MFGs (1-10 | j, m i diameter) genom avknoppning, varvid inhöljda av Mesc apikala plasmamembranet 40-42. Amning upphör efter valpar är avvanda, och de MESCs successivt dör genom apoptos, vilket leder till regression av bröstvävnad till en pubertets tillstånd (Figur 1B, involution). Immunofluorescens (IF) är en vanlig analytisk laboratoriemetod som används i nästan alla aspekter av biologi, både inom forskning och klinisk diagnostik. IF-tekniker kan utföras på vävnadssnitt (immunohistokemi, IHC) eller cell (immunocytokemi ICC) prover. Denna kraftfulla synsätt bygger på användning av fluorescent-märkta antikroppar som specifikt binder (direkt eller indirekt) till antigenet av intresse, vilket möjliggör visualisering av dess vävnadsfördelning genom fluorescensmikroskopi. Fluorescens signaler beror främst på kvaliteten och koncentrationen av antikroppar och korrekt hantering av provet. En enkel indirekt immunofluorescens (IIF) protokollet presenteras för att detektera mjölkprodukter (kaseiner och MFGs) och proteiner som är involverade i mjölkproduktutsöndring (butyrophilin (btn1), snara proteiner) på frysta sektioner av mus bröstvävnad (Figur 3). Även om detta protokoll ger en komplett IHC översikt, allt från vävnadsuppsamlings bilden efterbehandling, kritisk och valfria steg samt några tekniska rekommendationer också presenteras och diskuteras.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dissection</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pins</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ethanol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Scissors</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel and adapted blades</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ice</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Towel paper</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tissue sample preparation</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td>
			<td style="width:155px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT compound/Tissue Tek</td>
			<td style="width:155px;">Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose (D-saccharose)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:155px;">Dominique Dutscher</td>
			<td>39910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cryostat/sample support</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Razor blades (SEC35)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>152200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Slide box</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>10143560W90/1014356190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Brushes</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IHC</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Permanent marker (black)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:239px;">50 mM NH4Cl in PBS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A-0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">0.1 M glycine in PBS</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>24403.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heater (up to 100&#176;C)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td>
			<td style="width:155px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000/H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>CORN2980-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nail polish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences 
			Center, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Biolegend (Covance)</td>
			<td>MMS-162P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-115-P0/P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:239px;">Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted S. Tooze 
			(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td>ab3348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-025-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counterstains</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bodipy 493/503</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Observation/Image capture</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">conventional fluorescence microscope</td>
			<td style="width:155px;">Leica Leitz DMRB 
			microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Standard filters for FITC, Rhodamine 
			and DAPI emissions,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&#710;F software (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss LSM 
			510 microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Plan-Apochromat &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CLSM 510 software,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Image treatment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.49k software</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td>Free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

Indirekt immunofluorescens användes för att detektera och lokalisera proteiner av intresse i en vävnad. Protokollet presenteras här beskriver en komplett och enkel metod för immundetektering av proteiner, varvid musen lakterande bröstkörteln tas som ett exempel. Ett protokoll för framställning av vävnadsprover, särskilt när det gäller dissektion av mus bröstkörtel, vävnadsfixering och frusen vävnad sektionering, är detaljerade. Ett standardprotokoll för att utföra indirekt immunofluorescens, inklusive en valfri antigenåtervinning steg, presenteras också. Observationen av de märkta vävnadssnitt samt bildtagning och efterbehandlingar anges också. Detta förfarande ger en fullständig översikt, från samlingen av djurvävnad till den cellulära lokaliseringen av ett protein. Även om denna allmänna metod kan tillämpas på andra vävnadsprover bör det anpassas till varje vävnad / primär antikropp par studerades.

Bröstkörteln är en subkutan körtel som ligger längs den ventrala struktur både bröstkorgen och buken hos gnagare. Placeringen av de fem par körtlar i musen under dräktigheten visas i figur 4. Morfologi bröstkörteln förändras dramatiskt under dess utveckling, vilket avspeglar funktionella förändringar som krävs för att förbereda sig för full amning (Figur 1B). I jungfru eller fött ungar djur, bröstkörteln består av ett glest förgrenad...

Watch this Scientific Journal Video about Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Den indirekt immunofluorescens protokoll som beskrivs i denna artikel gör det möjligt att upptäcka och lokalisering av proteiner i mus bröstkörteln. En komplett metod ges för att framställa bröstkörtelprover, för att utföra immunohistokemi, för att avbilda de vävnadssnitt genom fluorescensmikroskopi, och att rekonstruera bilder.

Indirekt immunofluorescens på frysta sektioner av Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

indirect-immunofluorescence-on-frozen-sections-of-mouse-mammary-gland

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunohistokemi på Paraffinsnitt av Mouse Epidermis med fluorescerande antikroppar

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Mus bröst epitelceller formen Mammospheres Under Lactogenic Differentiering

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Förändringar i bröstkörtlarna Morfologi och bröstcancerrisk hos råttor

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffininbäddade och frysta snitt av Drosophila Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolering av Mouse Saliv celler Gland Stem

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Utvärdering av bröstkörtlarna utveckling och funktion i musmodeller

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Single Cell transkriptionell Profilering av Vuxen mus Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Intraductal Injektion för Lokaliserad Drug Delivery till Mouse bröstkörtel

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effekt av Male tillbehör Gland Produkter på äggläggning i snäckor

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolering av intakt, hela musen mjölkkörtlar för analys av extracellulärmatrix uttryck och körtel morfologi

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...