Name: analysis of zebrafish larvae skeletal muscle integrity with evans blue dye
Uploaded: 2015-11-30T15:00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye at JoVE.com

Vi ønsker å takke Trent Waugh for hans teknisk assistanse. Vi erkjenner også Department of Pediatrics ved Hospital for Sick Children og Cure Medfødt muskeldystrofi (CMD) for deres generøse støtte til dette prosjektet.

1. Utarbeidelse av Agar Injection Plates (Tid: 45 min) <ol><li> Kok 2% til 3% agarose i E3 media og la oppløsningen avkjøles litt på benken. Merk: antall injeksjons plater blir utarbeidet tilsier mengden agarose nødvendig. Hver injeksjon plate trenger ca 35 ml av agarose løsningen. </li><li> Etter koking, la agarose avkjøles til ønsket temperatur er nådd (f.eks., 45 ° C) som per injeksjon mold produsentens instruksjoner. </li><li> Hell ca 35 ml av den avkjølte agarose i en 100 mm fatet. </li><li> Plasser den ene enden av foretrukne injeksjon mold inn i løsningen, deretter legge resten av mugg på agarose løsning (dette vil bidra til å redusere forekomsten av luftbobler). </li><li> Tillat oppløsningen å størkne agarose, enten ved romtemperatur eller 4 ° C i ca. 30 min. </li><li> Bruke en spatel for å skille den ene ende av formen fra den faste agarose. Sakte fjerne resten av m<html> gammel. </li></ol> 2. Utarbeidelse av Evans blå Dye (EBD) Injection Mix (Tid: 30 min) <ol><li> Lag en 1% lager av EBD i 1X Ringer løsning (155 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 2 mM Na 2 HPO 4; 10 mm HEPES, 10 mM glukose, pH til 7,2), som kan lagres ved romtemperatur. </li><li> Lag en stamløsning av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -dextran MW 10 000 kDa ved 25 mg / ml i 1X Ringers løsning og oppbevares ved -20 ° C. </li><li> Forbered injeksjon blanding ved å fortynne EBD til 0,1% direkte i stamløsning av FITC- dekstran lager (dvs. for en endelig arbeidsvolum på 100 pl. Bland 10 mL av 1% EBD i 90 mL av FITC dekstran lager). </li><li> Grundig vortex injeksjon mix (det skal bli grønn) og holde ut av direkte lys ved å pakke injeksjon blandingsrøret i aluminiumsfolie. </li></ol> 3. EBD Injection Forberedelse (Tid: Ca 30 min) ent &quot;&gt; Merk: Protokoll fungerer best med larver fra 3-7 dager etter befruktning (DPF). <ol><li> Pre-varm injeksjon plate til RT. </li><li> Sett opp injeksjonsapparatet ved å arrangere mikromanipulator på metallplaten og står ved siden av mikroskopet som brukes for injeksjon. Slå på luftdrevet mikroinjeksjon kontrolleren. Merk: Den foretrukne innsprøytingssystemet vil variere fra lab og bør ikke endre utfallet av analysen. </li><li> Tilbake fylle kanyle med ca 2-4 ul EBD mix. </li><li> Kalibrere injeksjonsvolum på ca 5 nl av EBD mix. Merk: Injeksjonsvolum kalibrering vil være avhengig av kalibreringsmetode. Et stempel drevet injeksjon kan direkte settes til en gitt injeksjonsvolum, mens gasstrykket injektorer må injeksjonsvolum kalibrerte via volum bolus med bruk av et mikrometer. </li><li> Våt injeksjon plate med 1X Ringers løsning og fjerne overflødig fra brønner. </li><li> Pre-treat larver med 0,04% etyl-3-aminobenzoat methanesulfonate salt (Tricaine) fortynnet i 1 x Ringers løsning for å immobilisere larver før start av injeksjonen. Merk: Sikre larvene er helt immotile er viktig som riktig injeksjons er vanskelig med noen rest bevegelse. </li><li> Plasser bedøvet larver i brønner på agar-plater ved hjelp av et injeksjonsglass pipette. Sørg for at larvene er helt innenfor det godt og ligge på deres side. Merk: Antallet larver per brønn er opp til eksperimentator. </li><li> Etter larvene er satt i brønnene, fjerne overflødig Ringers løsning for å minimere larver bevegelse i brønnen. Legg igjen en restmengde løsning slik at larvene ikke dehydrerer. </li></ol> 4. Perikard Injeksjon av Sebrafisk Larver med EBD (Time: Avhengig av antall larver sprøyte, anslått 1-3 timer) <ol><li> Plasser injeksjon plate inneholdende larvene på en dissekere omfang hvor injeksjonene vil bli utført. </li><li> Plasser injeksjon pipette nål inneholderEBD blande over en sebrafisk larver. </li><li> Re-posisjon injeksjons plate ved å vri det slik at kanylen er i nærheten av larver hjerte og ca 45 ° ventralt fra anterior-posterior aksen. </li><li> Sett injeksjonsnålen inn i den felles kardinalvene (CCV) i området av venen ved fremre del av eggeplomme, hvor venen innledningsvis å dreie i ryggretningen (figur 1). Merk: En forstørrelse på opptil 40x kan være nyttig å tydelig se CCV. </li><li> Injisere 5 nl av EBD mix og holde kanylen på plass for 5-8 sek for å minimere umiddelbar lekkasje av EBD mix. Merk: En god injeksjon vil ha fargestoff farge sett i hjertekamrene (figur 1). Hvis EBV blanding ikke er observert i hjerte, deretter injisere ytterligere 5 nl av EBV blandingen kan være tilstrekkelig til å indusere fargestoffopptak. Alternativt, kan embryoet kastes. Merk: I noen situasjoner kan hjertet stoppe juling. Hvis dette occurs, fortsette å overvåke larvene for 20-40 sek. Vanligvis fortsetter hjertet slår som fargestoff beveger seg gjennom sirkulasjonssystemet. </li><li> Gå til neste larver og gjenta. </li><li> Identifisere hell injiserte embryoer ved å observere nærværet av FITC-dekstran i vaskulaturen umiddelbart etter injeksjonen (figur 2). </li></ol> 5. Inkubasjon og EBD Opptak (Tid: 4-6 timer) <ol><li> Etter det ønskede antall larver injiseres, retur injisert larver til 1X Ringers løsning uten Tricaine i 100 mm retter. </li><li> Hold retter innpakket i aluminiumsfolie. Merk: Holde injisert larver i mørket øker betydelig overlevelse og sikrer størst konsekvens i signalstyrke. Innpakning i aluminiumsfolie er spesielt viktig for den tidsperioden som larvene er utenfor inkubatoren. </li><li> Tillat larver inkubert ved 28,5 ° C i 4-6 timer for å sikre tilstrekkelig EBV-opptak. </li></ol&gt; 6. Visualisering av EBD i Muscle (Time: Avhengig av antall larver injisering og type mikroskopi, estimert 0,5-3 time) <ol><li> Før bildebehandling, bedøve larvene med 0,04% Tricaine å hindre bevegelse. </li><li> Vis larver i henhold til rød fluorescens for å bestemme om EBV opptaket skjer i skjelettmuskulaturen (fig 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Duchenne+muscular+dystrophy+(DMD)+for+the+pediatricians+in+the+community.">Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community.</a> Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).</li><li>Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+into+prominence:+the+zebrafish+as+a+valuable+tool+for+studying+human+myopathies+and+muscular+dystrophies).">Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies).</a> FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).</li><li>Lancet, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , 381-845 (2013).</li><li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dystrophin+glycoprotein+complex:+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma.">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).</li><li>Campbell, K. P., Kahl, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+dystrophin+and+an+integral+membrane+glycoprotein.">Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein.</a> Nature. 338, 259-262 (1989).</li><li>Cohn, R. D., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+muscular+dystrophies.">Molecular basis of muscular dystrophies.</a> Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).</li><li>Yoshida, M., Ozawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+complex+anchoring+dystrophin+to+sarcolemma.">Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma.</a> J Biochem. 108, 748-752 (1990).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).</li><li>Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+dystrophic+muscle+fibers+in+mdx+mouse+by+vital+staining+with+Evans+blue:+evidence+of+apoptosis+in+dystrophin-deficient+muscle.">Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle.</a> J Biochem. 118, 959-964 (1995).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).</li><li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+muscle+disease+in+zebrafish.">Modeling human muscle disease in zebrafish.</a> Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).</li><li>Cavanna, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+genetic+mapping+of+the+mouse+mdx+locus.">Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus.</a> Genomics. 3, 337-341 (1988).</li><li>Bassett, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo.">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li><li>Horstick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stac3+is+a+component+of+the+excitation-contraction+coupling+machinery+and+mutated+in+Native+American+myopathy.">Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy.</a> Nat Commun. 4, (1952).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield 3rd, ., M, L. I., Zon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li><li>Whitfield, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral.">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral.</a> , 123-241 (1996).</li><li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies.">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, (2013).</li><li>Waugh, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+prevents+dystrophic+changes+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 .</li><li>Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+embryonic+and+larval+zebrafish+skeletal+myofibers+from+dissociated+preparations.">Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations.</a> J Vis Exp. 50259, (2013).</li><li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays.">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. 50925, (2013).</li><li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo.+marker+of+myofibre+damage:+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability.">Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li><li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+isolation+and+characterization+of+a+splicing+mutant+of+zebrafish+dystrophin.">Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin.</a> Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Majczenko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+Mutation+of+CCDC78+in+a+Unique+Congenital+Myopathy+with+Prominent+Internal+Nuclei+and+Atypical+Cores.">Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores.</a> Am J Hum. , (2012).</li><li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Evans+blue+dye+to+compare+limb+muscles+in+exercised+young+and+old+mdx+mice.">Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice.</a> Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).</li><li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).</li></ol>

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Sebrafisk er fremstår som et kraftig verktøy for studier av nevromuskulær sykdom 2,29. Til dags dato har sebrafisk systemet blitt brukt til å validere ny muskelsykdomsfremkallende mutasjoner 16,17,30, belyse nye pathomechanisms 18, og identifisere potensielle nye terapeutiske legemidler 12,24. Disse kollektive innsatsen har etablert nytten av sebrafisk for å modellere menneskelige nevromuskulære sykdommer. Men til tross for fremskritt gjort med sebrafisk og pattedyr modeller, det er begrenset behandlingstilbud for pasienter innenfor det brede spekteret av nevromuskulære forhold. Derfor foreligger det et stort behov for terapi utvikling for denne gruppen av ødeleggende sykdommer. Paralleling denne etterspørselen for therapeutics er tilsvarende behov for løpende eksperimentelle innovasjon, samt grundige analyser for å verifisere nye dyremodeller og mulige terapeutiske strategier. EBD analyse er vanligvis brukes i musemodeller tilStudien vev og celleskader i hjernen, hjerte og skjelettmuskel 27,31. Mest spesielt er EBD mye brukt i musemodeller av ulike muskeldystrofi subtyper å vise hvor alvorlig muskelmembranen ustabilitet og skade åtte. Bruken av EBD å avsløre muskel membranskade er en støttende parameter etablere likheter av dyremodell for det menneskelige sykdomstilstand 9. Kraften i EBD i mus har ledet flere laboratorier, inkludert vår egen, for å utvikle og anvende EBD til sebrafisk modeller av nevromuskulær sykdom. På grunn av anvendeligheten av EBD analyse, er denne teknikken aktivt blir iverksatt for å underbygge sebrafisk modeller for det menneskelige sykdomstilstand 11,15,22,24,32. Larver med skadde muskel membraner vil ha EBD opptak og derfor rød fluorescens i muskelfibrene. Fluorescens observert i inter-fiber plass, men ikke innenfor enkelte muskelfibre kan også være lærerikt av fibre løsne fra kjelleren membran i than fravær av membranskade, og gir nyttig diagnostisk detalj. EBD analyse har potensial søknad utover dyremodell validering. Innsats fra vårt laboratorium har nylig vist at EBD analyse er gunstig i validere potensielt nye terapeutiske legemidler 24. Avgjøre om potensielle terapeutiske behandlinger redusere eller avskaffe EBD opptak i nevromuskulær sykdom modellene kan betegne relevant terapeutisk virkning 8. Denne type analyse kan bidra til å etablere mekanisme (r) av terapeutiske midler og utvider anvendelsen av EBV-analyse. Som med mange teknikker, betyr EBD analyse har flere begrensninger som skal følges under eksperimentell design og praksis. For eksempel kan det være utfordrende å identifisere CCV på grunn av fortykkelse av vevet med alderen. I tillegg er det lett å skade larver i forberedelse før og under pericardial injeksjonen, redusere eksperimentelle punkter og øker behovet for å prep stort antall larver.Videre kan fysisk skade gjort til larver under håndtering og injeksjon føre til falske positiver som skadet muskel kan ta opp EBD. For å overvinne noen av disse hindringer har vi beskrevet en ko-injeksjon strategi i denne video artikkelen som gir enkel og pålitelig identifikasjon av larver med vellykket fargestoff infusjon umiddelbart etter injeksjon og før etterfølgende analyse. FITC-dekstran ko-injeksjon kontroller for vellykket injeksjon ved å tillate bekreftelse av EBV i vaskulaturen før dens opptak av muskelfibrene. Dette kan være spesielt nyttig som EBD fluorescens blir svært diffus i larver etter flere timer hvis ikke samlet inn i muskelfibrene; som sådan kan det være vanskelig å oppdage. I tillegg mangler CCV og injisere EBV inn i eggeplomme eller kroppshulrommet kan, etter inkubering resulterer i diffust rødt fluorescens lignende for å styre embryoer, men med den reduserte sannsynlighet for opptak av skadede muskelfibre. Kollektivt, disse huleats foreslå EBD injeksjon krever tålmodighet og praksis for å oppnå konsistente og pålitelige resultater. I alle, beskriver vi en praktisk og grei metode for å utføre EBD analyser på sebrafisk larver. Hittil har bruken av sebrafisk som et modellsystem, særlig som et menneske sykdomsmodell, er blitt raskt voksende. Denne utvidelsen er delvis på grunn av fortsatt utvikling og endring av eksperimentelle teknikker som forbedrer på dagens fordelene av sebrafisk system. EBD injeksjonsteknikk gir en ekstra og kraftig verktøy til en forsker arsenal for validering og studiet av sebrafisk muskelsykdomsmodeller. Den pågående implementering og modifikasjon av denne teknikk har mulighet for å bidra til å avdekke nye terapeutiske strategier samt sykdomsfremkall mekanismer.

Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">FD10S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Evan&#39;s Blue Dye</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">100 mm Petri dish</td>
			<td style="width:173px;">Fischerbrand</td>
			<td style="width:140px;">FB0875712</td>
			<td>Injection mold base</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">Thin wall glass capillaries</td>
			<td style="width:173px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:140px;">TW100F-4</td>
			<td>For Injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Agarose</td>
			<td style="width:173px;">Bioshop</td>
			<td style="width:140px;">AGA001</td>
			<td>Injection mold</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Microinjection mold</td>
			<td style="width:173px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:140px;">TU-1</td>
			<td>Injection mold</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:173px;">Bioshop</td>
			<td style="width:140px;">SOD001</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:173px;">Bioshop</td>
			<td style="width:140px;">POC888</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">M2670</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S9638</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">HEPES</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">H4034</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Glucose</td>
			<td style="width:173px;">BioBasic</td>
			<td style="width:140px;">GB0219</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">C1061</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of zebrafish larvae skeletal muscle integrity with evans blue dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

Den EBV-injeksjon blandingen ble injisert i CCV av sapje homozygote mutanter og villtype-søsken på 3 dpf. Injeksjoner som fylte hjertekamrene (figur 1B) ble deretter analysert for vellykket injeksjon ved å visualisere FITC-dekstran i vaskulaturen i henhold til grønn fluorescens (figur 2). Etter en 4 timers inkubasjonstid, ble EBD opptak undersøkt ved somitt nivå ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Villtype-søsken viste ingen fluorescens EBV innenfor noen synlige muskelfibre (figur 3A), mens de sapje homozygote EBV mutanter viste opptak, noe som indikerer skade på muskelmembranen 15 (figur 3B). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig1.jpg" /> Figur 1. Injisering EBD injeksjon blandes inn i vanlig kardinal vene (CCV) av en sebrafisk Embryo. (A) ikke-injiserte embryo. Arrow betegner ideell beliggenhet for CCV injeksjon. (B) Vellykket injeksjon i CCV. Fargestoffet kommer inn i hjertekamrene (pil) og begynner å bli pumpet gjennom vaskulaturen. (C) En mislykket CCV injeksjon vil resultere i noen eller alle av fargestoff inn i plommesekken av embryo (pil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig2.jpg" /> Figur 2. Embryoet kan sorteres etter vellykket injeksjon ved å observere FITC- dekstran distribusjon henhold grønn fluorescens hele blodkar umiddelbart etter injeksjon og før EBD opptak.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig3.jpg" /> Figur 3: EBV vil bli tatt opp av fibre med skadede membraner (A) viser villtype-søsken ingen EBV fluorescens i muskelfibrene.. (B) Sapje ​​homozygot mutant med EBD fluorescens innen flere muskelfibre (piler). All larver ble injisert med EBD injeksjon mix og analysert etter en 4 timers inkubasjonstid på 3 dpf. Søsken og mutanter ble sortert etter muskelfiber avløsning før CCV injeksjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye at JoVE.com

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Fange Tissue Repair i Sebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikros

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induksjon av akutt Skeletal Muscle Regenerering av Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Microstructured enheter for optimal Microinjection og bildebehandling for sebrafisk larver

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anvendelse av kronisk stimulering å studere kontraktile aktivitet-indusert rotte Skjelettmuskel fenotypiske tilpasninger

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikasjon av Skjelettmuskel satellitt celler av Immunofluorescence med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolasjon, kultur, karakterisering, og differensiering av Human Muscle stamceller fra skjelettmuskelen biopsi prosedyre

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Utføre menneskelige Skjelettmuskel Xenotransplantater i Immunodeficient mus

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Isolering og differensiering av primær Myoblasts fra mus skjelettlidelser Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele Immunohistokjemi i sebrafiskembryoer og larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Undersøke muskelregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...