Name: working with human tissues for translational cancer research
Uploaded: 2015-11-26T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par les contributions philanthropiques de la John G. et Marie Stella Memorial Foundation Kenedy (Grant N ° 0727033) et l&#39;Alliance Melanoma Research. Les auteurs tiennent à remercier l&#39;Université de tissus Cancer Center Texas MD Anderson institutionnelle de la Banque (ITB) de coordonner la distribution des tissus et de la collecte et de faciliter la recherche translationnelle, ainsi que le Dr Ignacio Wistuba, le Dr Victor Prieto, le ministère MD Anderson Cancer Center de Pathologie et le Programme de tir mélanome Lune. Enfin, les auteurs tiennent à remercier tous les patients et les familles touchées par le mélanome.

Déclaration éthique: Ce protocole est approuvé par l&#39;Université du Texas MD Anderson Cancer Center. 1. Echantillon achats <ol><li> Prélever des échantillons de tissus de recherche du surplus tumeur et les tissus normaux connexes 10-12. Stocker les spécimens sur la glace humide pour éviter autolyse. </li><li> Envoyer tous les tissus, les dispositifs médicaux et les corps étrangers enlevés au cours d&#39;une intervention chirurgicale pour le Département de pathologie pour examen néces...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+Fixing+problems+with+cell+lines.">Cell Biology. Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346, 1452-1453 (2014).</li><li>van der Worp, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+animal+models+of+disease+reliably+inform+human+studies.">Can animal models of disease reliably inform human studies.</a> , (2010).</li><li>McCabe, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+disease.">Animal models of disease.</a> Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).</li><li>Woolf, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis.">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li><li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis.">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li><li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages.">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. 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En fin de compte, les méthodes de traitement doivent être dictées par l&#39;hypothèse souhaité et prévu des essais techniques à effectuer (Figure 1). La section suivante sert un aperçu de décrire dosages potentiels qui peuvent être effectuées sur ces coupes de tissus. Il est en aucun cas un aperçu exhaustif, mais est destiné à aider à guidage méthodes de traitement des échantillons et choix des essais en aval en décrivant les techniques et la liste de leurs forces et faiblesses. <p...

La recherche médicale a énormément bénéficié de l&#39;étude de deux lignées de cellules humaines et des modèles animaux. Les lignées cellulaires permettent un meilleur contrôle des composants dans un système, ainsi que l&#39;utilisation de cellules de l&#39;organisme approprié. Travailler avec des cellules humaines, tandis que plus représentatif, présente un aperçu simplifié radicalement les mécanismes qui peuvent être responsables de la santé et de la maladie, parce que les lignées cellulaires peuvent ne pas récapituler l&#39;impact d&#39;autres cellules stromales, composants et organes qui peuvent influer sur les réponses 1. D&#39;autre part, les modèles animaux, mais pas tout à fait exact de reproduction dans la maladie humaine et l&#39;hétérogénéité génétique, offrent un meilleur aperçu en permettant l&#39;entrée de systèmes animaux entiers dans la plupart des modèles 2,3. Lacunes côté, les deux méthodes ont leurs avantages et sont complémentaires. Cependant, l&#39;objectif principal reste à étudier les cellules et d&#39;organes humains, dans un système multi-organe corps entier. En conséquence, la recherche translationnelle a taken de grands progrès en vue de faciliter l&#39;étude des organes et tissus humains extraites de patients, afin de mieux saisir les mécanismes maladie sous-jacente. La recherche translationnelle offre l&#39;avantage d&#39;étudier le résultat des traitements et des maladies dans tout le corps et dans les cellules appropriées, fournissant ainsi le meilleur des deux mondes entre la cellule et animale travail 4. La recherche translationnelle est également pas sans défauts. Spécimens récoltés provenant de patients humains, lors de l&#39;enlèvement de l&#39;hôte, sont immédiatement soumis à une ischémie et d&#39;autres facteurs externes à partir de laquelle ils seraient autrement protégés. Cela peut entraîner des changements moléculaires et génétiques induites par le stress, et causer des biais dans les études ultérieures. Par conséquent, beaucoup d&#39;efforts ont été mis en extraction et le traitement des tissus par des méthodes strictes de préserver au mieux l&#39;orgue et l&#39;intégrité des cellules pour des études en aval 5. Surtout, les applications futures doivent être considérés de près lors de la sélection des méthodes of traitement des échantillons humains, que certaines méthodes peuvent être préjudiciables à des composants cellulaires et les voies de signalisation tout en épargnant les autres. Pour toute recherche impliquant des tissus humains, les questions de réglementation doivent être abordées. Après les rapports de Tuskegee et Belmont, il y avait une acceptation croissante du fait que la recherche biomédicale a été associée à des risques inhérents résultant souvent des dilemmes éthiques inévitables 6. La nécessité de normes nationales a été reconnue et le gouvernement fédéral a créé Institutional Review Board (IRB) comme un moyen de faire respecter les principes du Rapport Belmont (respect des personnes, la bienfaisance, de la justice). La CISR de toute institution est un comité de médecins, les chercheurs et les membres de la communauté qui sont responsables de la protection des participants à la recherche. Il exige que le consentement volontaire être obtenu à partir de tous les participants des études de recherche biomédicale, et que ce consentement soit documentée dans un consentement éclairé fo<html> rm. Le processus de consentement éclairé vise à fournir des informations adéquates à un participant, de sorte qu&#39;une décision éclairée peut être faite ou non d&#39;inscrire dans une étude, ou de continuer à participer. À cet égard, le document de consentement éclairé doit avoir une bonne lisibilité et doit être écrit dans un langage qui peut être facilement comprise (6 e à 8 e niveau de lecture de qualité) par la population cible. La possibilité de la contrainte ou influence indue doit être minimisée, et le sujet doit être donné suffisamment de temps pour envisager une participation. Le participant doit également être autorisés à exercer leur droit de retirer son consentement à tout moment au cours de l&#39;étude, sans pénalité. Consentement éclairé est un pré-requis obligatoire pour la participation d&#39;un sujet dans la recherche et il est aussi légalement à compter du 7. Comme par les règlements pour la protection des sujets humains 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), les participants de l&#39;étude doivent être informés de l&#39;objet de la recherche, les procédures impliquées dans la recherche, les alternatives à la participation, tous les risques prévisibles et les malaises (y compris non seulement des blessures physiques, mais aussi un préjudice psychologique, sociale, économique ou possible, d&#39;inconfort ou gêne), les avantages de la recherche pour la société et, éventuellement, à l&#39;individu, la durée de l&#39;objet devrait participer, personne à contacter pour obtenir des réponses aux questions ou dans le cas d&#39;une blessure liée à la recherche ou d&#39;urgence, une déclaration indiquant que la participation est volontaire et que le refus de participer ne sera pas entraîner des conséquences ou toute perte d&#39;avantages tels que un compromis dans les soins cliniques réguliers que le participant est autrement habilité à recevoir en raison de son / ses diagnostics, et enfin une déclaration concernant le droit de la personne à la confidentialité et le droit de se retirer del&#39;étude à tout moment sans aucune conséquence. Les échantillons de tissus de participants qui se retirent consentement au cours de l&#39;étude ne devraient pas être mis en réserve et doivent être immédiatement épuisées. Renonciation à un ou plusieurs éléments du consentement éclairé peut être obtenu à partir de la CISR pour certains projets de recherche qui pourraient pratiquement pas se faire sans une modification des éléments requis ou pour des études où les éléments nécessaires ne sont pas applicables. Un grand soin doit être pris pour assurer la confidentialité des données. La Loi sur la responsabilité Health Insurance Portability et (HIPAA) est une loi fédérale qui empêche utiliser ou de divulguer «renseignements protégés de la santé&quot; (PHI) sans le consentement écrit des participants. PHI comprend mais ne se limite pas à l&#39;information de santé transmis ou maintenu sous quelque forme ou moyen et comprend des champs qui pourraient être utilisés pour identifier une personne 9. Grâce à ce travail, nous visons à décrire le protocole qui doit être suivi pendant tissue traitement - y compris les achats, le stockage et soulignent l&#39;importance de suivre ces lignes directrices strictes de manière à minimiser les biais qui peuvent résulter en raison des contraintes d&#39;un tissu est soumis à lors de l&#39;extraction. Nous nous efforçons également de fournir un bref aperçu des essais ou d&#39;analyses (Figure 1) qui pourraient être effectuées sur ces échantillons en aval afin que les lecteurs peuvent porter un jugement qualifié sur ce test (s) convient le mieux à leurs besoins.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel disposable scalpels</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>58931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-stabilizing solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MAX-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>StatLab Medical Products</td>
			<td>28600-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Containers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-032-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature solution (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m cell strainers</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead stain solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

working with human tissues for translational cancer research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

<html> Les résultats affichés ci-dessous illustrent l&#39;écoulement stratégie cytométrie de déclenchement d&#39;une large phénotypage immunitaire sur une tumeur de mélanome traités. Le jour de la coloration, l&#39;échantillon de tissu a été digéré avec de la collagénase et on les homogénéise et DNase I I incubation pendant 60 min, à 37 ° C sous 225 RPM rotation. Après la digestion, la suspension cellulaire a été filtrée à travers un tamis cellulaire de 70 um pour éliminer les débris et les cell...

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Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

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