Name: cell sorting of neural stem and progenitor cells from the adult mouse subventricular zone and live-imaging of their cell cycle dynamics
Uploaded: 2015-09-14T18:00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics at JoVE.com

אנחנו אסירי תודה ל- C ז&#39;ובר, V נוויל, V Barroca, J טיליאט וכל צוות של מתקני בעלי חיים; לJ Baijer וN Dechamps למיון תא; O. אטיין לקבלת סיוע טכני, וא Gouret לסיועה המנהלי. Cytometry זרימה ומיון תא בוצעה בiRCM cytometry הזרימה המשותפת למשאב, שהוקמה על ידי מענקי ציוד מDIM-גזע-קוטב, INSERM, Fondation ARC, וCEA. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של חברת חשמל הצרפתי (EDF). יש MD מלגה מLa הליגה העל Contre le הסרטן וLM מאזור איל-דה-פראנס (DIM Biothérapies). מארק-אנדרה Mouthon ופרנסואה ד Boussin מחבר מניות שותף בכיר.

<ol>
	<li>Morshead, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells.">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li><li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).</li><li>Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone+astrocytes+are+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain.">Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain.</a> Cell. 97, 703-716 (1999).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+migration+of+neuronal+precursors.">Chain migration of neuronal precursors.</a> Science. 271, 978-981 (1996).</li><li>Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neural+stem+cells+bridge+their+niche.">Adult neural stem cells bridge their niche.</a> Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).</li><li>Rietze, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+pluripotent+neural+stem+cell+from+the+adult+mouse+brain.">Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain.</a> Nature. 412, 736-739 (2001).</li><li>Fischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+adult+neural+stem+cells+from+the+mouse+subependymal+zone.">Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone.</a> Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).</li><li>Daynac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+neural+stem+cells+exit+dormancy+upon+alteration+of+GABAAR+signaling+following+radiation+damage.">Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage.</a> Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).</li><li>Codega, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+and+purification+of+quiescent+adult+neural+stem+cells+from+their+in+vivo+niche.">Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche.</a> Neuron. 82, 545-559 (2014).</li><li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+functionally+distinct+stem+cells+and+neurosphere-initiating+cells+in+adult+mouse+forebrain.">Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain.</a> Elife. 3, e02669 (2014).</li><li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LeX+ssea+1+is+expressed+by+adult+mouse+CNS+stem+cells+identifying+them+as+nonependymal.">LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal.</a> Neuron. 35, 865-875 (2002).</li><li>Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mCD24+expression+in+the+developing+mouse+brain+and+in+zones+of+secondary+neurogenesis+in+the+adult.">mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult.</a> Neuroscience. 73, 581-594 (1996).</li><li>Pineda, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+derived+TGF-beta+increases+in+the+stem+cell+niche+and+perturbs+neurogenesis+during+aging+and+following+irradiation+in+the+adult+mouse+brain.">Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain.</a> EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).</li><li>Lugert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+and+active+hippocampal+neural+stem+cells+with+distinct+morphologies+respond+selectively+to+physiological+and+pathological+stimuli+and+aging.">Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging.</a> Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).</li><li>Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+neural+stem+cell+number+in+a+growth+hormone+dependent+manner++augmenting+the+regenerative+response+in+aged+mice.">Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice.</a> Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).</li><li>Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+the+subventricular+zone+neural+stem+cell+niche+evidence+for+quiescence+associated+changes+between+early+and+mid+adulthood.">Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood.</a> Neuroscience. 173, 135-149 (2011).</li><li>Enwere, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+results+in+reduced+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+diminished+olfactory+neurogenesis+and+deficits+in+fine+olfactory+discrimination.">Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).</li><li>Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+detection+characterization+and+age+related+changes+in+the+subventricular+zone+of+mice.">Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).</li><li>Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+alpha+null+and+senescent+mice+show+decreased+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+forebrain+subependyma.">Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).</li><li>Costa, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+division+and+lineage+progression+in+vitro.">Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro.</a> Development. 138, 1057-1068 (2011).</li><li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+and+lineage+progression+of+neural+progenitors+in+the+ventricular-subventricular+zones+of+adult+mice.">Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).</li><li>Sakaue Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell+cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).</li><li>Daynac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+lengthens+the+G1+phase+of+stem+cells+in+aged+mouse+brain.">TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain.</a> Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).</li><li>Roccio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+stem+cell+fate+changes+by+differential+cell+cycle+progression+patterns.">Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns.</a> Development. 140, 459-470 (2013).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse+two+cultures+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice.">One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres+re+evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open+a+critical+review+of+sphere+formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Spella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Licensing+regulators+Geminin+and+Cdt1+identify+progenitor+cells+of+the+mouse+CNS+in+a+specific+phase+of+the+cell+cycle.">Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle.</a> Neuroscience. 147, 373-387 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no conflict of interest.

טכניקת מיון התא המתוארת במסמך זה מאפשרת אפליה בין NSCs אמין השקטים, NSCs מופעל ומחקרי הצאצאים מאפשרים של הנכסים שלהם ואת הדינמיקה במוח הבוגר 9. בשילוב עם טכנולוגית FUCCI המאפשר ההדמיה של התקדמות מחזור התא בתאים חיים 23, שפתחנו טכניקה מהירה ויעילה למעקב G 1 וSG 2 / M השלבים של מחזור התא ממבוגרים צעירים ותאי מוח עכבר גילאים. טכניקת תא מיון שימוש בפרוטוקול זה הייתה שילוב תוקף הראשון של סמנים המאפשרים טיהור של חמש האוכלוסיות עצביות העיקריות מSVZ 9. זה היה גם הטכניקה הראשונה תוקף מאפשרת את ההבחנה של NSCs שקט והופעל. ראוי לציין כי טכניקה זו אינה דורשת שימוש בעכברים מהונדסים כשלעצמה, אשר הוא הכרחי כאשר מותאם לדגמי עכבר מהונדסים suפרק כFUCCI. מאז, קודגה et al. 10 השתמשו שילוב תיוג משולש GFAP-GFP / CD133 / EGFR להבחין NSCs שקט מעמיתו הופעל אבל זה לא יכול להיות מותאם לטכנולוגית FUCCI כפי שהוא דורש שימוש בעכברים מהונדסים GFAP-GFP. מישיגן et al. 11 פיתחו / EGFR / אסטרטגית Glast CD24 משולשת תיוג שמחולקת תוצאות משותפות עם הטכניקה המשמשת במחקר זה 9. ואכן, מתאם גבוה בין לקס וסמני Glast NSCs כבר נצפה באל Daynac et. ללמוד 9. עם זאת, נוגדני Glast משמשים במישיגן et al. הטכניקה הוא מצמידים את Phycoerythrin ולכן לא יכולים להיות מותאמים לשימוש בעכברים FUCCI-אדומים. יש כמה נקודות טכניות חשובות שדורשות תשומת לב לפני מיון תאי SVZ. ראשית, צעד הניתוק הוא מאוד חשוב כמו רקמת המוח יש ניתק לתוך תאים בודדים תוך שמירה על המבנה בטגריטי של החלבונים המשמשים לאסטרטגית תיוג נוגדן. 0.05% טריפסין-EDTA הוכח כיעיל מאוד בdissociating רקמת SVZ 27 אבל אנטיגן לקס נמצא רגיש מאוד שכן כמעט כל immunofluorescence LEX-FITC היה אבוד (מידע לא מוצג). לפיכך, פפאין שימש כזה היה יותר יעיל ופחות הרסני מאשר פרוטאזות אחרת ברקמת המוח. יתר על כן, לא לקס ולא EGFR ולא CD24 הושפע טיפול פפאין. יש לציין כי תיוג הנוגדן שונו אם טיפול פפאין עלה 15 דקות. השגנו תוצאות אופטימליות עם טיפול פפאין 10 דקות הקשורים ניתוק מכאני (פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים). ציפוי פולי-D-ליזין מאפשר תרבות של תאים חסיד והיווצרות המושבות לאחר מספר ימים בתרבות. עכשיו זה מקובל כי במבחני חוץ גופית מגיע עם המגבלות שלהם 28,29. אנו ממליצים קביעת מחזור התא הראשון רק להתאים עוברים החלוקה לפחות אחד לאחר להישאר קרוב ככל האפשר לin vivo פנוטיפ התא. ראוי לציין להזכיר כי חלבוני Geminin (הקרינה ירוקה) וCdt1 (הקרינה אדומה) המשמשים לעיצוב מערכת FUCCI 23 הוצגו בעבר לבוא לידי ביטוי בשפע על ידי אבות עצביים במהלך הנוירוגנזה מוקדמת בעכברים 30 וברקמות מוח בוגר 9,25 . למרות מבנה mKO2-hCdt1 (30/120) היה בעיקר בשימוש במחקר הנוכחי לעקוב שלב G1 עם הקרינה אדומה, השימוש בשני המבנים [mKO2-hCdt1 (30/120) וMAG-hGem (1/110) ] יכול להיות שחזה כדי לאפשר ההדמיה של השלבים העיקריים של מחזור התא (1 G וSG 2 / M), כמו גם את המעבר / S G 1 23. החסרון העיקרי של ההדמיה כפול הצבע הוא הסטים תואמים המוגבלים של הקרינה שעדיין יכול לשמש לתיוג התא. פתרון אחד הוא להשתמש separatiעל עמודים. לדוגמא, יש לנו בהצלחה מדולדלת חלק CD24 חיובי מהתאים באמצעות עמודות הפרדה לפני תא מיון ולחיות הדמיה כפי שנהגנו נוגדן CD24-PE שחלק את אותו אורך גל הפליטה מקרינת FUCCI-האדומה 25. מחקרים מעטים בחנו את אורך מחזור התא של אוכלוסיות SVZ העכבר מבוגרות. אורך מחזור התא הכולל שהושג עם הטכניקה שלנו הוא קרוב לאחד מוערך במבחנה על ידי קוסטה et al. 21, אבל הצלחנו בפעם הראשונה להבחין שלבי מחזור התא השונים. במחקר in vivo, פונטי et al. 22 השתמש בשילוב של תחליפי תימידין כדי לקבוע את דינמיקת ההתפשטות של אוכלוסיות תאי SVZ השונות. עם זאת, הם יכולים גם לבצע ניטור רציף של מחזור התא ולא לעקוב אחר התאים ברמת התא הבודד. זה יכול להיות נושא כפי שהראה כי ההטרוגניות חזקה קיימת שנינותהין אוכלוסיית תאי SVZ נתון 22,25. אנו מתארים כאן חלופיים בטכניקת מבחנה, קל להתקנה, המאפשר ההדמיה החיה של שלבי מחזור התא של אוכלוסיות עצביות מבוגרות שונה ברמת תא בודד. הבנת הרגולציה של מחזור התא של תאי גזע עצביים ואת אבות עדיין מהווה אתגר לפיתוח גישות טיפוליות חדשות בהקשר של פתולוגיות הזדקנות או מוח. כך הפרוטוקול שלנו יכול להיות מגוון רחב של יישומים. בהקשר של הזדקנות, טכניקה זו יכולה להיות יעילה גם כדי להבין את ההשפעות של הזדקנות על בידול NSCs. ואכן, ניתן לזהות תאי גזע / עצביים נכנסו בידול כעוצמת הניאון האדום שלהם היא במובהק גבוהה יותר 26. לבסוף, זה יכול להיות גם עניין לנצל את ההדמיה לחיות רציפה ברמת תא בודד ללמוד תהליכים פנימיים וחיצוניים התא אחראים לפרו השושלתgression של NSCs המבוגר.

תאי גזע עצביים רגיעה (NSCs) הם המקור לneurogenesis מבוגרת 1 ויכולים להמיר שגשוגם &quot;מופעל&quot; צורה המבטאת את EGFR (aNSCs) 2. לאחר הפעלה, הם להצמיח תאי מעבר הגברה (TACs) 3 ולאחר מכן neuroblasts שנודדים לנורות חוש הריח (OB) דרך צינור של האסטרוציטים ולבסוף להתמיין נוירונים 4,5. NSCs וצאצאיהם מאורגנים ב&quot; נישות &quot;מיוחדות ארכיטקטורות לאורך החדרים לרוחב, לסבך את מספר עצום של גורמי שליטה התפשטותם 6. הבידוד והטיהור של תאים עצביים SVZ יש צורך להאיר את הרגולציה המולקולרית המורכבת של ההפצה שלהם, אבל נשאר אתגר במשך זמן רב בשל חוסר סמנים ספציפיים וטכניקות מותאמות. גישות חדשות באמצעות cytometry זרימה שניתנו אפשריות הבידוד של NSCs וtheiצאצאי r מהמבוגרים SVZ 2,7-11. באמצעות סמן תאי גזע 12 LEX יחד עם CD24 neuroblast סמן 13 וEGF הקרינה לתייג EGFR בתאים מתרבים 2, לאחרונה פיתחו אסטרטגית FACS מאפשרת הטיהור של חמש מהאוכלוסיות העצביות SVZ העיקריות: שקטה והופעלה NSCs, TACs, neuroblasts לא בוגר כמו גם הנודד 9. כאן אנו מתארים בפרטי תא זה מיון טכניקה ואיך לקס / EGFR / הכתמה משולשת CD24 אפשרה בפעם הראשונה את הבידוד של שני NSCs שקט והופעל. למרות neurogenesis נמשכת בבגרות, הייצור של תאי עצב חדשים הוא ירד באופן דרסטי במוח המזדקן 14. רוב המחקרים מסכימים על ירידה הדרגתית במספר מתרבים תאים בSGZ וSVZ 15-20. ההשלכות הן לא תמימות כמו הירידה הקשורות לגיל בהנוירוגנזה בSVZ מעוררת הפחתה של nנוירונים ewborn בנורות חוש הריח של המוח בגיל, סופו של דבר מוביל לירידת ערך באפליה חוש הריח בעכברים בגיל 18. הבהרת קינטיקה מחזור התא של אבות עצביים היא צעד מפתח להבנת מנגנוני ההתפתחות של neurogenesis למבוגרים במהלך הזדקנות. מחקרים שנעשו לאחרונה חקרו את מחזור התא והתקדמות שושלת של תאי גזע עצביים מבוגרים במבחנה 21 וin vivo 22 אבל אף אחד מהם ניצל טכניקות תא מיון ובדיקות מחזור תא ניאון מקודדים גנטיים כדי להמחיש את שלבי מחזור התא של תאים מבודדים ברמת תא בודד. כאן אנו מתארים פרוטוקול שמנצל את העכברים מהונדסים FUCCI שבו תאים הם פלורסנט במהלך מחזור התא שלהם, המאפשר ההבחנה בין G 1 וSG 2 / M שלבים 23. פרוטוקול זה מראה כיצד בידוד פוטנציאלי של NSCs וצאצאיהם ממבוגרי FUCCI מילCE בשילוב עם מיקרוסקופ וידאו הזמן לשגות מאפשר המחקר של דינמיקת מחזור התא ברמת תא בודד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well uncoated glass bottom culture plates&#160;</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P96G-1.5-5-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plates 96-well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A003E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult NSC Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult NSC Proliferation Supplement&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24010-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9128</td>
			<td>Ovomucoid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>BD Medimachine Filcon</td>
			<td>340622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtubes 3810X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1595</td>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7]</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14776</td>
			<td>Mouse IgM; clone MMA. 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>332778</td>
			<td>Rat IgG2b; clone M1/69.&#160; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human LeX antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>559045</td>
			<td>Mouse IgM; clone MAM.&#160; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 - conjugated EGF ligand</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>E35351</td>
			<td>1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBeads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>644204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS separation columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>separation columns (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgM microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>861405</td>
			<td>HO (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFLUX cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACS sorter (in the text)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>confocal laser scanning microscope (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>NIS-Elements software (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75)</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECLIPSE Ti thermostated chamber</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>thermostated chamber (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>RBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star, Ashland, OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUCCI mice</td>
			<td>RIKEN BioResource Center, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Sakaue-Sawano et al. 2008</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell sorting of neural stem and progenitor cells from the adult mouse subventricular zone and live-imaging of their cell cycle dynamics

תאי גזע עצביים (NSCs) באזור subventricular של החדרים לרוחב (SVZ) לקיים neurogenesis חוש הריח לאורך כל חיים במוח של היונקים. הם ברציפות לייצר תאי מעבר הגברה (TACs) וneuroblasts שלהתמיין נוירונים ברגע שהם לשלב נורות חוש הריח. תא הניאון מתעורר מיון פעיל טכניקות (FACS) אפשרו את הבידוד של NSCs כמו גם צאצאיהם והחלו לשפוך אור על רשתות רגולציה גן בנישות עצביות מבוגרות. אנו מדווחים כאן טכניקת מיון תא שמאפשרת לעקוב ולהבחין דינמיקת מחזור התא של אוכלוסיות תאים הנ&quot;ל מSVZ המבוגר עם לקס / EGFR / הכתמה משולשת CD24. לאחר מכן תאים מבודדים הם מצופים כמו תאים חסיד לחקור בפרטי התקדמות מחזור התא שלהם על ידי מיקרוסקופ וידאו הזמן לשגות. לשם כך, אנו משתמשים בעכברים מהונדסים מחוון סלולארי מחזור הקרינה Ubiquitination (FUCCI) שבו תאים אדומים-ניאון דוריןG G שלב 1 בשל כתב אדום-Cdt1 ספציפי G 1. שיטה זו חשפה לאחרונה כי NSCs מתרבים בהדרגה להאריך שלב G 1 במהלך הזדקנות, שהוביל לירידת ערך neurogenesis. שיטה זו היא בקלות transposable למערכות אחרות ויכולה להיות עניין רב ללימוד דינמיקת מחזור התא של תאי מוח בהקשר של פתולוגיות מוח.

היכולת להבחין באופן מהימן בין אוכלוסיות תאים השונות של שושלת תאי גזע SVZ העכבר הבוגר היא קדמונית לחקור תכונות הפונקציונליות שלהם. לשם כך, פיתחנו לקס / EGFR / אסטרטגיה משולש תיוג CD24 המאפשרת הטיהור של אוכלוסיות תאים ספציפיות מSVZ המבוגר: NSCs שקט (בהיר לקס), NSCs מופעל (LEX + EGFR +), TACs (+ EGFR) , Neuroblasts בוגר והנודד (CD24 + + EGFR וCD24 +, בהתאמה) 9 (איור 1). מוחל על עכברים הטרנסגניים FUCCI, מיון התא טכניקה מאפשר ההדמיה החיה של שלבי מחזור התא של האוכלוסיות העצביות השונות ברמת התא הבודד 25. עכברי FUCCI-אדומים שמשו למעקב השלב G 1 עם מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו באמצעות הקרינה אדומה (איור 2 א). תאי נג FUCCI-אדומים מייצגים את התאים בS-G 2 / M שלבים של מחזור התא, תאי קופה FUCCI-אדומים הם תאי G 1 ותאים בהירים FUCCI-אדומים הם תאי יציאה או ממחזור התא (איור 2) 23,26. לקס + + EGFR וEGFR + תאים ממבוגרים צעירים (איור 2 ג) ועכברים בגיל העמידה (איור 2 ד) היו מצופים כתאים חסיד על צלחות תרבות מצופים פולי-D ליזין. שלב SG 2 / M הראשון זוהה בתאים בודדים פעם אחת את הקרינה האדומה מכבה עד שהתא מתחלק. כפי שנצפה בעבר SG אורך שלב 2 / M לא הראה שום הבדל בין לקס + + EGFR וEGFR + תאים, או בעכברים צעירים או בגיל העמידה. אז חישבנו את אורך שלב G 1 הבא מהליגה הראשונה עד הקרינה האדומה מכבה. מעניין לציין, התארכות שלב G 1 נמצאה במהלך ההזדקנות בקס + EGFR אך לא תאים +בEGFR + תאים 25 (איור 2 ג, ד). כתוצאה מכך, neurospheres השיג 5 ימים לאחר ציפוי הם קטנים יותר בתאי קס + EGFR + התקבלו מעכברים בגילים כפי שמוצג באיור 2E. גם עכברים-ירוקים FUCCI יכולים לשמש כדי לחזות SG שלב 2 / M עם הקרינה ירוקה (איור 3 א &#39;, ב&#39;), אבל תאים צריכים להיות מראש מסודרים באמצעות עמודות הפרדה כנוגדן לקס-FITC משותף אותו גל הפליטה מFUCCI- הקרינה ירוקה (איור 3 ג). דוגמא לקרינת FUCCI-ירוקה לSG הראשון שלב 2 / M של מבוגרים צעירים לקס + EGFR + ותאי EGFR + מוצגת באיור 3D. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig1.jpg" /> איור 1:. אסטרטגיה של תא בחירה על ידי FACS תאים (א) היו ראשון שנבחרו על פי tמורפולוגיה יורש באמצעות פיזור בצד (SSC) לעומת פיזור קדימה פרמטרים (FSC). לפרטים נוספים על בחירת שער מורפולוגיה, מתייחס לDaynac et al. 9 (א &#39;) תאים מתים תויגו באמצעות סמן HO ולא נכללו בבחירה. (&#39; &#39;) כפילויות הוצאו באמצעות פרמטר רוחב דופק. כדי להגדיר את השערים, הקרינה מיון מינוס אחד (FMO) שולט לCD24-PC7 (LEX-FITC / FUCCI-אדום / EGF-Ax647 תיוג; B) ולקס-FITC (FUCCI-אדום / EGF-Ax647 / CD24 תיוג -PC7; ב &#39;) שימש (C, C. &quot;) ואז, שערי מיון נקבעו בקס-FITC / FUCCI-אדום צינורות שכותרתו / EGF-Ax647 / CD24-PC7 יחד עם בקרות FMO. האחוזים הממוצעים של תאים כולל מיוצגים בשערי. אם בחירת CD24 + תאים (neuroblasts), להיזהר שלא לכלול תאים לבטא בהירים CD24 מהשער. ואכן, המתאים בהיר CD24 לספירת ependymalLLS 2,9. ג &#39;מייצג את התאים השליליים CD24 (ריבוע שחור בC). רק לקס + + EGFR וEGFR + (ג &#39;) שערי מיון שמשו למחקר זה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig2.jpg" /> איור 2: ניתוחים בשידור חי של מחזור תא באמצעות עכברי FUCCI-אדומים ייצוג סכמטי של מחזור תא FUCCI-האדום שבו תאים אדומים-ניאון בשלב G1 וחסר צבע בSG 2 / M שלבים 23 ייצוג (B) FACS של (א).. הקרינה FUCCI-אדומה על תאי SVZ. (C, D) מיקרוסקופיה וידאו עם לקס + + EGFR וEGFR + תאים ממוינים מצעיר (C) וגיל העמידה (ד) עכברים FUCCI-אדומים מאפשרת המעקב של השלב G 1 עם הקרינה אדומה ואילו SG ניתן להסיק 2 / M שלבים when הקרינה האדומה מכבה. תמונות רצופות מוצגות בקנה מידת זמן שהוצג בD. (E) נציג תמונות של מושבות (neurospheres) השיגו 5 ימים לאחר ציפוי. בר סולם:. 10 מיקרומטר (C, D), 30μm (E) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53247/53247fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig3.jpg" /> איור 3:.. אסטרטגיה לניתוחים חיים של מחזור תא באמצעות עכברים FUCCI-ירוקים ייצוג סכמטי של מחזור תא FUCCI-הירוק שבו תאים ירוקים בSG 2 / M שלב וחסר צבע בשלב G 1 23 (א) ייצוג FACS (ב) של הקרינה FUCCI-ירוקה: תאי נג FUCCI-ירוקים מייצגים את התאים בשלב G 1 של מחזור התא ואילו FUCCI-Green תאי קופה הם תאים בSG 2 / M 23. (ג) על מנת לעקוב אחרי SG הירוק-ניאון 2 / M שלבים של לקס + EGFR + ותאי EGFR +, תאי SVZ היו צריכים מראש מסודרים עם עמודות הפרדה. תאים תויגו עם אנטי עכבר נוגדן לקס ולקס + חלק נשמרו על העמודה באמצעות microbeads אנטי עכבר (ראה פרוטוקול 4.). ואז, לקס + ולקס - שברים היו eluted ושכותרתו עם EGF-Ax647 ונוגדני CD24-PC7 למיון FACS (ד &#39;) במיקרוסקופ וידאו של לקס + + EGFR וEGFR + תאים ממוינים מעכברי FUCCI-ירוקים צעירים מאפשר המעקב של. SG 2 / M שלבים עם הקרינה ירוקה. תמונות רצופות מוצגות בקנה מידת זמן שהוצג בD. בר סולם: 10 מיקרומטר (ד).

Watch this Scientific Journal Video about Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics at JoVE.com

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

אזור Subventricular En פנים: מכתים Wholemount ושפל Ependymal

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

התקדמות מחזור תא הערכה של גזע עצבי ובתאים במוח המתפתח העכבר, למרות מתח genotoxic

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...