Name: detection of intracellular gene expression in live cells of murine, human and porcine origin using fluorescence-labeled nanoparticles
Uploaded: 2015-11-13T14:00:00
Duration: 8 min 14 s
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We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung and Deutsche Gesellschaft f&#252;r Thorax-, Herz- und Gef&#228;sschirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum f&#252;r Herz- und Kreislaufforschung S&#228;ule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).

メディア、試薬および細胞培養条件の作製<ol><li>ヒトHEK 293胚性腎細胞<ol><li> DMEM /ハムのF-12培地中で培養HEK 293細胞（CRL-1573、ATCC）を5％のFCS、L-グルタミン（2mM）、​​ペニシリン（100 U / mlの）/ストレプトマイシン（100μg/ ml）を補充しました。 </li><li>通路に細胞は、PBSで細胞を1回洗浄し、0.05％トリプシン/ EDTAを添加し、37℃で3分間、5％CO 2インキュベートします。 15ミリリットルチューブに細胞を移す、1200 RPM（300×g）で 5分間遠心分離し、新鮮なT25培養フラスコに約5×10 5個の細胞を移します。 </li></ol></li><li>マウス胚性線維芽細胞（MEF） <ol><li>個々の6ウェルに0.1％ゼラチン溶液1mlを加え、1時間室温（RT）でインキュベートします。使用するまで室温で吸引除去液とストア。 </li><li> DMEMで培養MEFを10％FCS、L-グルタミン（2mM）、​​L-グルコース（4.5グラム/リットル）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、及びペニシリン（100 U /を補っゼラチンコーティングした6ウェルプレート上ミリリットル）/ストレプトマイシン（100μg/ mlの）。 </li><li> 6ウェルプレートにMEFのを配布し、それらが合流するまでに成長しましょう​​。細胞を停止するために2.5時間マイトマイシン（5μg/ ml）を追加します。培地を吸引、完全なMEF培地で2回細胞を洗浄し、各6ウェルに3ミリリットルにMEF培地を追加します。これらの細胞は、マウスおよびブタiPS細胞用のフィーダー層として機能します。 </li></ol></li><li>マウスESおよびiPS細胞の培養<ol><li>マウスES培地を調製するために、15％FCS、L-グルタミン（2mM）、​​L-グルコース（4.5グラム/リットル）、MEM非必須アミノ酸（1X）、βメルカプトエタノール（0.1ミリモル）を含むDMEM培地を補充そして白血病抑制因子（1.000 U / mlで）。 </li><li>無血清DMEMで一度増殖停止のMEFで6ウェルを洗浄し、2ミリリットルのマウスES培地およびマウスiPS細胞（コンフルエント皿の細胞の20％）を追加します。毎日洗浄細胞は、一度、無血清DMEMで、2mlの新鮮なマウスES培地を追加します。 </li><li>通過に細胞は、0を追加し、無血清DMEMでも一度それぞれを洗います.25％トリプシン/ EDTA、37℃で3分間、5％CO 2インキュベートします。転送15mlチューブへの細胞、1200 RPM（300×g）で 5分間遠心分離、500μlのマウスES培地中で再懸濁細胞とで6ウェル新鮮で2ミリリットルのマウスES培地に懸濁液100μlを追加MEFフィーダー層。 </li></ol></li><li>豚iPS細胞の培養<ol><li>ブタのiPS培地を調製するために、補足DMEM /ハムのF-12培地、20％ノックアウト血清、L-グルタミン（2mM）、​​MEM非必須アミノ酸（1X）、βメルカプトエタノール（0.1ミリモル）、及びペニシリン（100とU / ml）の/ストレプトマイシン（100μg/ mlの）。 2〜3週間、4℃で0.22μmのフィルターとストアを介してフィルタリングします。最初の使用時には、bFGFを（最終濃度10ng / ml）を追加します。 </li><li>無血清DMEM / HamのF-12で一度増殖停止のMEFで6ウェルを洗浄し、1.5ミリリットル豚のiPS媒体およびブタiPS細胞（コンフルエント皿の細胞の10％）を追加します。一度無血清DMEM / HamのF-1との毎日の洗浄細胞2と追加1.5ミリリットルの新鮮な豚のiPS媒体。 </li><li>解離緩衝液を調製するには、のCa 2+を含まない PBSに2.5％トリプシン、コラゲナーゼIV（10 mg / mlで）、ノックアウト血清（20％）とのCaCl 2（1ミリモル）を加えます。 PBSで細胞を2回洗浄し、37℃で5分間、5％CO 2の解離緩衝液でインキュベートします。 1200 RPM（300×gで）で5分間、15mlチューブ、遠心分離機に転送細胞。 </li><li> 500μlの新鮮な豚のiPS培地中のブタiPS細胞を再懸濁し、MEFフィーダー層で新鮮な6ウェルに1.5ミリリットル豚のiPS媒体に懸濁液50μlを添加します。毎日の洗浄細胞に一度無血清DMEM / HamのF-12と追加1.5ミリリットルの新鮮な豚のiPS媒体と。 </li></ol></li><li>ヒトiPS細胞のフィーダーフリーの文化<ol><li> 4℃での基底膜調製物を含む元のバイアルを解凍し、さらに使用するまで-20℃で8 mg / mlの、アリコートと店に氷冷無血清DMEM / HamのF-12で希釈します。 </li><li>ベースのアリコートを解凍メント膜4℃で準備し、氷冷無血清DMEM /ハムF12（90μgの/ ml）で希釈しました。ピペット1 3センチ培養皿にこの溶液mlの全面が覆われることを確実にするために穏やかに旋回。 1週間まで4℃でパラフィルムや店舗で料理をシール。細胞培養に使用する前には、基底膜調製物の重合を可能にするために、37℃で30分間または室温で3時間、皿をインキュベートします。 </li><li>皿から培地を吸引は、基底膜調製物でコーティングし、無血清DMEM / HamのF-12で二回洗浄します。培養皿とヒトiPS細胞（コンフルエント皿の細胞の10％）に1.5ミリリットルE8媒体を追加します。毎日の洗浄細胞に一度無血清DMEM / HamのF-12と1.5ミリリットルを追加新鮮E8媒体と。 </li><li>通過に細胞は、PBSで2回料理をすすぎ、1mlのPBS / 0.5 mMのEDTAを追加します。室温で5分間皿をインキュベートします。顕微鏡下で細胞を監視します。注意：コロニーは切り上げし始め、付ときARは、彼らが転送の準備ができている穴を持っています。 </li><li> 、液体を吸引1.5ミリリットルE8媒体を加え、穏やかにピペッティングにより細胞を剥離。転送15mlチューブに細胞、1200 RPM（300×g）で 5分間遠心分離、500μlのE8媒体中で再懸濁し、基底膜調製物でコーティングされた新鮮な培養皿に1.5ミリリットルE8媒体に懸濁液の50μlのを追加。 </li></ol></li></ol>種国境を越えた対象系列の2デザイン<ol><li>選択基準、ヒト、マウスおよび標的遺伝子（GAPDH、NANOG、GDF3）のブタcDNA配列およびCLUSTAL多配列アラインメント分析を行います。 注意：これは、種間の相同配列を示します。 <ol><li> 3を実行するために、ギャップペナルティ（固定）10、ギャップペナルティ（変化）5、遷移重み0、ギャップ分離ペナルティ範囲8、遅延40のための％同一性、最大反復回数：複数のアライメントのための次の設定を使用します。 </li></ol></li><li>プローブの設計と製造のための製造業者（材料の表を参照のこと）に対して所望の標的配列を提出してください。 注：メーカーは、その後の技術で所望の配列の互換性を確認します。所望の配列に互換性がない場合、製造業者は、代替のシーケンスを提案します。 <ol><li>潜在的な捕獲鎖配列として使用することができ、相同領域は、27塩基対の長さを有していることを確認してください。 注：これは、唯一の真の細胞実験は、個々のシーケンスの機能の明確な証拠を与えるよう選択された標的遺伝子のための異なる捕捉鎖を持つ複数のナノ粒子を注文することをお勧めします。三つの異なるナノ粒子がNANOGの発現を評価するために試験されたつつ、GAPDH及びGDF3のための2つの異なる配列を評価しました。その場所と正確なシーケンスは、他の場所で17公開されています。メーカーは、商業的にnanopを製造所望の配列を有する物品及び凍結乾燥形式でそれらを提供します。 </li></ol></li></ol> 3.ナノ粒子の再構成と細胞培養に加え<ol><li>暗闇の中で4℃で受信したときに、凍結乾燥ナノ粒子を保管してください。 </li><li> 100nmの最終濃度を与える50μlの蒸留水を添加することによってナノ粒子を再構成します。一度暗闇の中で、室温で保存するナノ粒子を再構成しました。注：この状態では、それらは少なくとも1年間安定です。 4℃で再構成したサンプルの記憶に悪影響その安定性に影響を及ぼし得ます。 </li><li>アプリケーションの日に2（HEK293細胞）または8 nMの（のiPSとES細胞）の濃度にPBSでナノ粒子原液を事前に希釈します。注：この濃度は、培養皿中の最終濃度よりも20倍高いです。 ES細胞やiPS細胞では、ナノ粒子の400 pMの顕微鏡下で容易に検出可能な蛍光シグナルを誘導しました。 HEK293細胞については、交流100ピコモルのoncentrationで十分です。 </li><li> 24ウェル237.5μlの完全な細胞培養培地を含有する予備希釈ナノ粒子のピペット12.5μlの。異なるサイズのウェルには、それに応じてボリュームを調整します。ナノ粒子の平等な分配を確保するために慎重にプレートを渦巻。加湿雰囲気中で37℃で細胞を一晩（O / N）および5％CO 2でインキュベートします。 </li><li>蛍光顕微鏡下で - （640 nmの発光575）次の日に546 nmでの励起波長を持つ遺伝子特異的Cy3蛍光のための細胞培養物を分析します。注：十分に強い蛍光を得るために必要な期間は、細胞型および標的遺伝子に依存してもよいです。これらの実験では、これは、プローブの適用後16および20時間の間に見られました。 </li></ol>フローサイトメトリーによるCy3の陽性細胞集団の識別4. <ol><li> R、セクション1.1または1.3で指定された条件を用いて、HEK293またはマウスES細胞を増殖させますespectively。 FACS分析前にある日は、ES細胞をネズミ293細胞（ 図6Aを参照）HEK 400 pmにするために、異なる濃度で、GAPDH特異的ナノ粒子を追加します。加湿雰囲気中でO / N、37℃で細胞を、5％CO 2でインキュベートします。 </li><li>蛍光顕微鏡下で遺伝子特異的Cy3で誘起蛍光のための細胞培養を分析します。 </li><li>ポイント1.1.2の下で指定されているHEK 293細胞を切り離します。遠心分離は、200μlの氷冷PBS / 0.5％BSA / 2mMのEDTA（FACS緩衝液）1.5 mlチューブを再懸濁に移します。フローサイトメトリー分析まで氷上に暗い細胞を保管してください。 </li><li>ポイント1.3.3の下で指定されているマウスES細胞を外します。遠心分離は、200μlの氷冷PBS / 0.5％BSA / 2mMのEDTA 1.5 mlチューブを再懸濁に移します。フローサイトメトリー分析まで氷上に暗い細胞を保管してください。 </li><li>プレス細胞凝集を防止し、ヨウ化プロピジウムを追加するために、30μMフィルターを通して細胞（2 / mlの最終濃度）2分死細胞を排除するために、FACS分析の前に。 </li><li>最初のFSC-A / SSC-サブセット上の階層のゲートを設定したCy3陽性細胞を分析するために、FSC-H / FSC-W-サブセットおよびSSC-H / SSC-Wサブセット。細胞の破片と散乱されていない細胞を排除するために、前方および側方散乱を使用してください。 PE-テキサスレッドに対して、PEを表示自分のヨウ化プロピジウム染色によって死細胞を除外します。 Cy3-PE陽性細胞の最終ソートゲートを実行します（ 図4）。 </li></ol>

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本研究は、蛍光顕微鏡下で、多様なhistogenetic起源と異なる哺乳動物種からの生細胞に直接細胞内の遺伝子発現の信頼性の評価を可能蛍光ラベルされたナノ粒子の使用を記載しています。このアプローチは、他の公表された方法に比べて利点がいくつかあります。まず研究の標的遺伝子または細胞型のいずれかに関して限定されるものではありません。すべての抗体ベースの検出方法は、単一のエピトープに制限されています。蛍光分子ビーコンはまた、遺伝子の広いスペクトルのために設計することができるが、この方法は、細胞とそれに続くヌクレオ15の解離を必要とします。対照的に、遺伝子特異的なナノ粒子の適用は、エンドサイトーシスによって積極的にナノ粒子を飲み込む標的細胞のいずれかの操作を必要としません。その後の継代の間、金粒子は徐々に細胞を残し、文化がdownstreaに使用することができますM実験。 それにもかかわらず、技術もまだいくつかの制限があります。いくつかのマーカーは、そのようなSSEA-1、TRA-1-81 20としての炭水化物の性質は明らかに検出されません。現在では、ナノ粒子の大規模な配列は、市販されています。これらの粒子は、細胞の実験ではその機能のためにあらかじめテストされています。本研究の目的は、種の国境を越えて使用することができるカスタマイズされたプローブを設計することでした。新規標的遺伝子いずれかのプローブを設計する際に、このようなアプローチを以下の場合、またはin silicoでの機能は、プローブが完全にin vitroで評価する必要があると予測することを認識することがあります。 NANOG-SF1は1マウスにおけるミスマッチ塩基およびブタ配列に素敵な蛍光シグナルを生成しながら、配列相同性に100％の相同性を示したNANOG-SF3プローブは全く動作しませんでした。もう一つの問題は、ナノ粒子の効率的な取り込みを指します。粒子が入りますエンドサイトーシス、ナノ粒子21の大きさに影響されるプロセスによる細胞は、細胞型及び分化状態22と細胞が食細胞の機能を実行し、23のマクロピノします。満足な蛍光シグナルを得るための最適濃度は、個々のアプリケーションまたは細胞株について試験されなければなりません。そのために、最初の実験は、常に、標的特異する遺伝子発現の検出に移動する前に、細胞タイプおよび培養条件内プローブの適合性を評価するために、取り込み制御を適用すべきです。 新規な細胞株または細胞集団に、このプロトコルを適用した場合、信頼できる結果を得るための重要な点は、適切なコントロールを含めることです。これまで蛍光取り込み制御は、ナノ粒子の濃度は、標的細胞集団に十分な蛍光シグナルを誘導するヒントを提供します。蛍光が評価されなければなりませんD信号として、次の日は、時間17でフェードインします。同時に、同一の濃度で適用真核生物のゲノム中の対応のないスクランブル制御は無視できるバックグラウンドシグナルを誘導しなければなりません。第三の制御としては、ハウスキーピング遺伝子（例えば、GAPDH、βアクチン ）のための特定のナノ粒子を使用することをお勧めします。これらのナノ粒子は、方法は、選択された標的細胞集団に特異的な遺伝子発現を検出することができる陽性対照として役立ちます。これらのコントロールが判明した場合、良好一つは他のターゲット遺伝子に特異的ナノ粒子を使用して、信頼性の高い特定の蛍光シグナルを得ることを期待することができます。それらが標的配列24をダウンレギュレートすることが示されているように適用されるナノ粒子の濃度はまた、重要であり得ます。しかし、この効果は、ここ（400 PM）に提示した実験で使用される濃度よりもはるかに高い濃度（5 nM）を必要とします。この濃度でnanoflaRESは、標的遺伝子mRNAまたはタンパク質レベルおよびHEK293およびマウスES細胞17の増殖を阻害しない2 nmと高濃度に影響を与えません。また、全ゲノム発現解析は、遺伝子発現の25の有意な変化を示さありませんでした。したがって、1 nMのまでの濃度でnanoflaresは重要な悪影響を示してはなりません。 この技術の非常に有望なアプリケーションは、特定の遺伝子によってマークされている任意の細胞集団を標識するための可能性です。近年、遺伝子特異的ナノ粒子が首尾よく選択ライブ心室筋26、黒色腫細胞27、単球28および小脳細胞培養物29の亜集団を染色するために使用されています。このような蛍光標識された細胞集団を生細胞として、フローサイトメトリーによってソートし、精製することができます。腫瘍学の分野では、動物モデルにおいて転移性腫瘍生細胞を単離することが想像され潜在的な転移促進遺伝子または標的構 ​​造の探索のための最も貴重な、CEAの発現に基づいて。我々は最近、真に再プログラムマウスのiPSコロニーが検出された蛍光強度に基づいて、17 のNanog特異的ナノ粒子とその場で識別することができることを示しています。したがって、真に再プログラミングのiPSコロニーの同定は、最も有望なコロニーを同定するためにロボットの蛍光検出とピッキング装置を使用するハイスループットプラットフォーム上で実行することができます。この技術は、特定の細胞亜集団を選択するために多くの研究分野で適切であると思われ、それはハイスループットプラットフォームにナノ粒子を適用することが可能と思われます。結論として、このプロトコルは、生細胞内で直接細胞内の遺伝子発現の検出を可能にする蛍光標識されたナノ粒子を用いた新規アプローチを表します。この技術は、浄化拡大し、さらに文字に貴重なツールとすることができます多くの研究分野では珍しい携帯亜集団をIZE。

2006年には、新たなアプローチは、多能性の状態に体細胞を再プログラムすることが記載されました。潜在的な再プログラミングの配列のプレスクリーニングした後、マウスの線維芽細胞が正常に人工多能性幹細胞（IPS）、レトロウイルス形質導入および4転写因子の過剰発現による、いわゆるに変換する可能性のある要因（ のOct4、Sox2の、Klf4の、C-Mycの ）1。その後、この技術は、効果的に人間2、サル3、ラット4、犬5、羊6、豚7を含む別の哺乳動物種の体細胞を用いて再現されています。また、C-MYC、潜在的に発癌性転写因子を省略または交換プロトコルが変更された8,9を公開されています。 かかわらず、最初の再プログラミングの、増殖するコロニーの真の多能性を確認する必要があり、面倒で時間のかかる作業に近づきます。主な欠点これらの分析の大部分、それらが生細胞で行うことができないということです。確立されたそのようなOCT4、SOX2、NANOGまたはREX1等の多能性因子は核内に位置する転写因子を表し、それらの検出は、従来のRT-PCR分析10のための免疫組織化学または細胞溶解への細胞の固定必要- 12をその後、これらの細胞は将来のために失われます各コロニーの複製培養を必要とする実験。 したがって、生細胞に多能性を分析するための技術は、非常に望ましいです。 12いくつかのアプローチが実際に膜ベースの抗原に対する抗体を使用して、生細胞上で直接実行することができる（ 例えば 。TRA-1-60、SSEA4）、蛍光は、アルカリホスファターゼに特異的胚性幹（ES）の標識13または小分子を検出するための染料を報告しましたそして、iPS細胞14を 。しかし、抗体は、それにもかかわらず、不利な細胞や各メタに影響を与える可能性がありますODは、単一の多能性マーカーに制限されています。最後に、蛍光分子ビーコンは、細胞の生の染色を可能にするヘアピン構造、デュアルアンチセンスオリゴヌクレオチドは、15に記載されています。このアプローチは、多くの遺伝子に適用することができるが、この技術は、成長のiPSコロニーに適用されない単一細胞懸濁液のヌクレオを必要とします。 数年前に、遺伝子特異的なナノ粒子は、ヒトSKBR3乳癌細胞16内サバイビンの発現を分析するために記載されています。この原稿は、金ナノ粒子複合体の使用を使用して、ライブESおよびiPS細胞における多能性マーカーを検出するための新規の革新的なアプローチを説明します。これらのナノ粒子は、相補的なRNA配列を有する結合された捕獲鎖との中央の金粒子とCy3標識レポーター鎖で構成されています。レポーター鎖の蛍光シグナルは、中央金粒子によりクエンチします。また、適切なナノ粒子は、（ 図1）は、それぞれ、負および正の対照として役立ちます。 （ 図3）を適用するためのナノ粒子は、単に培地（ 図2）に添加し、エンドサイトーシスを介して細胞に入ります。標的RNAが発現されている場合には、その後、蛍光シグナルを発するレポーター鎖を置換します。この方法は、標的細胞の操作を必要とせず、標的遺伝子の発現は、生細胞内で直接蛍光顕微鏡下で光学的にモニターすることができます。さらに、この技術はiPS細胞の場合には種を超えて任意の所望の標的遺伝子に適用することができ、多くの異なる研究分野で用いられてもよいです。最後に、フローサイトメトリーは、Cy3の陽性細胞の同定および濃縮を可能に分析します。

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#39;s F12 medium with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG4815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG0435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 107 409 001</td>
			<td>prevents cell division of MEFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor (107 U/ml)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>detaches adherent cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>supplement for human and porcine iPS cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>growth factor for human and porcine iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td>dissociation of pig iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05940</td>
			<td>defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartFlare Probes</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>customized item</td>
			<td>detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6144</td>
			<td>enhances attachment of MEFs to surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td>labels dead cells in flow cytometric analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Aria Illu</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>A4544</td>
			<td>referred to as device 1 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>775213</td>
			<td>referred to as device 2 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FloJo vX 10.0.7r2</td>
			<td>Treestar</td>
			<td></td>
			<td>software for analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of intracellular gene expression in live cells of murine, human and porcine origin using fluorescence-labeled nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

我々は、ヒトHEK293細胞中で構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子（GAPDH）を用いたパイロット実験を実施することを決定したナノ粒子を用いて、生細胞中の特定の遺伝子発現の細胞内検出を確認し、確立するための最初の試みです。これらの実験で使用されるナノ粒子の濃度は、製造業者の推薦に従って選択しました。 O / Nインキュベーション（ 図5A）の後、蛍光顕微鏡下で可視化されたこれらの細胞に明確なCy3で蛍光を誘発した100pMの最終濃度で培養培地へのGAPDH特異的プローブの追加。 2つのコントロールは、結果を実証するために、これらの実験に含めました。一つの制御は、レポーター鎖が、哺乳動物細胞または真核細胞内に一致する配列を有していない、いわゆる「スクランブル」ナノ粒子で構成されています。 「スクランブル」ナノ粒子は、非特異的バックグラウンドを決定fluorescen可能なプローブの劣化や蛍光の不完全な消光によるCE。スクランブルプローブの追加は無視できるわずかしか蛍光シグナル（ 図5B）を生成しました。永久蛍光「取り込み」制御は、異なる細胞型の間で変化し得るエンドサイトーシスにより、ナノ粒子を取り込む細胞の能力を決定するのに役立ちます。これらの陽性対照粒子は、HEK293細胞（ 図5C）に明るい蛍光信号を生成しました。したがって、ごくわずかなバックグラウンドシグナルと細胞内の遺伝子の特異的な蛍光シグナルを記録する技術の実現可能性を確認しました。これは、バックグラウンド信号と特定の蛍光の差が時間の経過とともに減少することが言及されなければなりません。特定の蛍光が（ 図5D）を徐々にフェードしながら、劣化や不完全焼入れをプローブに起因するバックグラウンドが高くなります。同じGAPDH特異的ナノ粒子が持っていますマウス、ブタおよびヒツジ起源17の主要な線維芽細胞培養物において試験されて。標的特異的蛍光は、おそらく、これらの培養物の比較的低い増殖能に起因するかなり弱いながら、これらの細胞は、HEK 293細胞よりもはるかに高いバックグラウンド信号を生成します。 これらのパイロット実験は、異なる種に由来のiPSにおける多能性遺伝子の発現を検出するためのこの技術を使用することを促しました。この目的のために、NANOG及びGDF3は、多能性細胞18内で発現することが知られているどちらも、分析しました。 Nkx2.5、心臓エンハンサートランスジェニックマウス線 19の尾部先端の線維芽細胞から誘導された最初のiPS細胞で調べました。強い蛍光シグナルが得られた両方の遺伝子（ 図6A）及びスクランブルコントロールの無視できる程度のCy3蛍光について（データは示さず）。同様の結果は、ヒトおよびブタiPS細胞（図6で得られました。B及びC）。重要なことは、蛍光シグナルは、IPSのコロニーに制限された、マウスおよびブタのiPS（ 図6Aと Cの矢印を参照）のためのフィーダー層として使用される繊維芽細胞を標識しませんでした。 NANOG遺伝子発現の分析はまた、in silicoで予測していないすべての列が最終的に機能している「良好」であるとことを明らかにしました。マウスiPS細胞（ 図6D）中の 100％の配列一致にもかかわらず、スクランブルコントロールに匹敵するほとんどの蛍光シグナルを誘導しないNANOG特異的ナノ粒子の三デザインの一つ。同様の結果が、ヒトおよびブタ由来のiPS細胞で得られました。このプローブを用いて（データは示さず）。したがって、ナノ粒子は、すべての単一の設計されたプローブの機能は事前に評価する必要がある一方で、種の国境を越えて多能性遺伝子の発現を検出することができます。 その場での有望な結果細胞培養皿中の生細胞の標識化は、フローサイトメトリーにより定量的遺伝子発現を分析することを促しました。この目的のためにGAPDH特異的ナノ粒子は、標的細胞集団内の標識効率を比較するために、293単層をHEKする段階的な濃度で添加しました。蛍光顕微鏡により評価すると強化されたのCy3誘導蛍光は、ナノ粒子を受けていない細胞と比較して最も低い濃度で見られました。ナノ粒子の濃度の増加は、 その場での HEK293細胞（ 図7A）の明らかに濃度依存性蛍光を誘導しました。フローサイトメトリー分析を、これらの細胞を供して、濃度依存性標識効率を確認しました。ナノ粒子の最高濃度は（ 図7B）を適用したときのCy3陽性細胞の頻度が有意（七倍以上に）増加しました。 Nkx2.5の心からのさらなる実験ではES細胞エンハンサーのトランスジェニックマウス系統19は、フローサイトメトリーによって、多能性遺伝子の発現を分析するために使用しました。正の取り込み制御の400 pMのでパイロット実験は、顕微鏡下で明らかにCy3の正のライブのESコロニーが得られたおよびCy3陽性細胞（ 図7C）のほぼ40％を検出したフローサイトメトリー。対照的に、未処理細胞に匹敵するスクランブルポジティブ染色で処理した細胞の約0.1％（データ示さず）。同様に、GAPDH、のNanog及びGDF3に特異的なナノ粒子の添加は、細胞培養皿の個々のコロニー内の異なる蛍光シグナルを誘導しました。フローサイトメトリーによって決定されるように、GAPDHのためのCy3陽性細胞の頻度は、両方の多能性遺伝子（ 図7C）で見られるものに匹敵しました。 Nanog及びGDF3はまた、多能性ES細胞で構成的に発現されると考えられるので、この結果は期待できます。従って、これらのデータは明らかにINDI特定の遺伝子を発現する細胞は、フローサイトメトリーによって同定することができることをケイトを定性的およびそれらの相対量によって、分析します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig1.jpg" /> 図1：ナノ粒子の構造の略図。遺伝子特異的ナノ粒子（A）の構造（B）スクランブルナノ粒子（ネガティブコントロール）。（C）取り込みナノ粒子（陽性対照）。ワイリーからの許可を得て転載、ラームら 17から適応。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig2.jpg" /> 図2：ナノ粒子の適用は、細胞培養物ナノ粒子の適切に希釈した溶液を単に培養培地にピペットで。 O後/ Nインキュベーション遺伝子特異的蛍光細胞は、AFの下に表示されています<html> luorescent顕微鏡。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig3.jpg" /> 図3：エンドサイトーシスを介して細胞によるナノ粒子の能動的取り込み（A）細胞が積極的にエンドサイトーシスによってナノ粒子を巻き込む（b）標的 mRNAが捕獲鎖に結合し、蛍光レポーターを置換します。。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig4.jpg" /> 図4：フローサイトメトリーのためのゲーティング戦略。 （A）戦略のマウスES細胞用HEK 293細胞（B）戦略。データは、マウスES細胞用HEK 293細胞またはデバイス2のための装置1を用いて取得し、その後ソフトウェアツール（材料の表を参照のこと）によって分析しました。 /53268fig5.jpg &quot;/&gt; 図5：HEK 293細胞におけるGAPDHの -expression解析 GAPDH特異的ナノ粒子は、100ピコモル（最終濃度）で細胞に添加し、蛍光をO / Nインキュベーション後に記録した（A）GAPDH特異的ナノ粒子（B。 ）スクランブル（陰性対照）。（C）取り込み（陽性対照）。（D）スクランブルおよび取り込み制御の速度論。蛍光は、GAPDH特異的ナノ粒子を添加した後、指示された時点で測定しました。スケールバーは50μmでを表します。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig6.jpg" /> 図6：異なる種の 400 PMに細胞に添加したNANOGまたはGDF3のためのナノ粒子の特定のiPS細胞における多能性遺伝子発現の解析 （最終concentration）蛍光をO / Nインキュベーション後に記録した。（A）マウスiPS細胞を（B）ヒト iPS細胞を、（C）ブタiPS細胞。 （A）及び（C）の矢印は、標識されていない線維芽細胞フィーダー層細胞を示す。マウスiPS細胞における（D）蛍光をNANOG設計SF3ナノ粒子を添加した後。スケールバーは50μmでを表します。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig7.jpg" /> 図7：ナノ粒子標識生細胞は、フローサイトメトリーにより同定することができます。フローサイトメトリーによって決定したCy3陽性細胞の（A）293細胞、ナノ粒子の異なる濃度を添加した後のCy3正HEKの顕微鏡図（B）周波数。（C）は、マウス ES細胞コロニーのライブ染色およびCy3正の周波数の決意細胞。ナノ粒子を添加しました400ピコモルの最終濃度で。スケールバーは50μmでを表します。

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Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

蛍光標識ナノ粒子を用いたマウス、ヒトおよびブタ起源のライブ細胞の細胞内遺伝子発現の検出

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