Name: stable and efficient genetic modification of cells in the adult mouse v-svz for the analysis of neural stem cell autonomous and non-autonomous effects
Uploaded: 2016-02-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects at JoVE

Nós reconhecemos a ajuda de MJ Palop eo apoio técnico do SCSIE da Universidad de Valencia. Agradecemos também a Antonia Follenzi pelos comentários e discussão do manuscrito. IF é apoiado pela Fundação Botín, pelo Banco Santander através da sua Divisão Global Santander Universidades, e por doações da Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP e ISIC) e Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED e RETIC Tercel) . Este trabalho também foi apoiada por BFU2010-21823 e RETIC Tercel doações de MINECO e pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC) 2012-StG (260511- PD-HUMMODEL) para AC BM-P. é o destinatário de uma bolsa FPI espanhola do MINECO.

ÉTICA DECLARAÇÃO: Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da Universidade de Valência, em conformidade com a Directiva Europeia 2010/63 / UE. 1. Geração de LV para In Vivo Marcação Estudos (veja a Figura 1-A) CUIDADO: O procedimento aqui descrito é o nível de biossegurança 2, portanto, executar todos os procedimentos a seguir em uma capa de risco biológico. Garantir que o pessoal de investigação são devidamente qualificados e treinados em todos...

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	<li>Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neural+stem+cells+bridge+their+niche.">Adult neural stem cells bridge their niche.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).</li><li>Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neural+stem+cells+and+their+niche:+a+dynamic+duo+during+homeostasis,+regeneration,+and+aging.">Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).</li><li>Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+progression+from+stem+cells+to+new+neurons+in+the+adult+brain+ventricular-subventricular+zone.">Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone.</a> Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).</li><li>Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+oligodendrocytes+in+the+subventricular+zone+of+the+adult+brain.">Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain.</a> J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).</li><li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain.">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche:+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions.">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).</li><li>Tavazoie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells.">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).</li><li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subventricular+zone+en-face:+wholemount+staining+and+ependymal+flow.">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Ramirez-Castillejo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pigment+epithelium-derived+factor+is+a+niche+signal+for+neural+stem+cell+renewal.">Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).</li><li>Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+from+the+choroid+plexus+to+the+subventricular+zone:+go+with+the+flow!.">The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!.</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li><li>Delgado, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+NT-3+delivered+by+vasculature+and+CSF+promotes+quiescence+of+subependymal+neural+stem+cells+through+nitric+oxide+induction.">Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction.</a> Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).</li><li>Kokovay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM1+is+essential+to+maintain+the+structure+of+the+SVZ+niche+and+acts+as+an+environmental+sensor+to+regulate+SVZ+lineage+progression.">VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).</li><li>Porlan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT5-MMP+regulates+adult+neural+stem+cell+functional+quiescence+through+the+cleavage+of+N-cadherin.">MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin.</a> Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).</li><li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lake-front+property:+a+unique+germinal+niche+by+the+lateral+ventricles+of+the+adult+brain.">Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain.</a> Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).</li><li>Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferr&#242;n, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+neural+stem+cells+in+the+subependymal+zone.">Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone.</a> Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).</li><li>Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+subventricular+zone+astrocytes.">In vivo targeting of subventricular zone astrocytes.</a> Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).</li><li>Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fari&#241;as, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+ex/in+vivo+assay+to+detect+effects+of+exogenously+added+factors+in+neural+stem+cells.">A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells.</a> Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).</li><li>Consiglio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+in+vivo+gene+transfer+into+adult+mammalian+neural+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).</li><li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Third-Generation+Lentivirus+Vector+with+a+Conditional+Packaging+System.">A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System.</a> J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Bomsel, M., Alfsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+viruses+through+the+epithelial+barrier:+pathogenic+trickery.">Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).</li><li>Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lentiviral+vector-mediated+transduction+on+the+tightness+of+a+polarized+model+of+airway+epithelium+and+effect+of+cationic+polymer+polyethylenimine.">Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine.</a> J Biomed Biotechnol. , (2010).</li><li>Bonazzi, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impenetrable+barriers+or+entry+portals?+The+role+of+cell-cell+adhesion+during+infection.">Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection.</a> J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).</li><li>Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherens+junction+formation+inhibits+lentivirus+entry+and+gene+transfer.">Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer.</a> PLoS One. 8 (11), (2013).</li><li>Yamashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone-derived+neuroblasts+migrate+and+differentiate+into+mature+neurons+in+the+post-stroke+adult+striatum.">Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum.</a> J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li></ol>

LVs oferecer vantagens importantes sobre outros sistemas virais para a modificação genética de adultos NSCs 16,18. entrega estereotáxica de lentivírus para o nicho V-SVZ representa um método eficiente para identificar e rastrear raramente dividindo B1-NSC superar as limitações de outros métodos vulgarmente utilizados tais como BrdU, que se dilui depois de múltiplas divisões celulares, ou retrovírus, que apenas células alvo que estão a proliferar no momento da aplicação. LVS juntamente com aden...

A zona ventricular-subventricular murino (V-SVZ), nas paredes do ventrículo lateral de frente para o corpo estriado, é uma região germinal muito activa, na qual um processo contínuo de replicação de células progenitoras e diferenciação resulta na produção persistente de bolbo olfactivo (OB ) interneurônios e oligodendrócitos corpo caloso 1. A geração ao longo da vida destas células parece ser apoiada pela presença nesta região de células neurais estaminais (NCCC, também chamado células B1), que expressam a proteína ácida fibrilar glial antigénio astrócitos (GFAP) e a haste marcadores celulares, tais como a nestina, Id1 e Sox2 2. GFAP-expressando células B1 gerar células (TAP) (células C), que expressam fatores de transcrição Dlx2 trânsito ampliando progenitor (distal-less homeobox 2) e Ascl1 (mamíferos achaete-Schute homólogo 1) e se dividem rapidamente algumas vezes antes de dar lugar a neuroblastos que migram (células a) ou oligodendroblasts 3. Recém-gerado prolifneuroblasts operatória migrar anteriormente, formando o fluxo migratório rostral (RMS) para o OB, onde eles integrar o granular e camadas glomerular como interneurônios inibitórios diferenciados. A migração de jovens oligodendroblasts passar para o CC, onde eles se tornam células imaturas NG2-positiva que continuam a dividir localmente ou se diferenciar em oligodendrócitos myelinating maduros 1,4. células B1, que derivam de células gliais radiais fetais, retêm a morfologia alongada e polarizada de seus antecessores e exibem uma relação altamente especializada, com o seu nicho. Eles abrangem entre a ependyma que alinha o ventrículo e da rede de vasos sanguíneos que irrigam o nicho V-SVZ. O pequeno processo apical das células intercala B1 entre ependimócitos multiciliated e termina em um único cílio primária não-móveis, ao passo que o seu processo basal estende longas distâncias para abordar o plexo vascular planar que irriga este nicho final no blamina asal dos capilares do plexo 2,5-8. A maneira mais confiável para distinguir B1-NSCs a partir de astrócitos não-neurogênicas, que também são GFAP +, no nicho V-SVZ intacto é baseado em preparações com parede lateral do ventrículo e sua análise por microscopia confocal 3-D de toda a montar depois imunocoloração para GFAP para rotular o processo apical fina B1-NSC, β-catenina para delinear as membranas celulares, e ambos os γ-tubulina como um marcador de corpos basais cilial ou acetilado α-tubulina para rotular a extensão de cada cílio 5,8. Observações destas montagens inteiras-a partir da superfície do ventrículo indicaram que as células ependimais e B1 estão dispostas em &quot;&quot; cata-ventos 5, em que os processos apicais uniciliated de um ou vários GFAP + B1 células são cercadas por uma roseta de células ependimais multiciliated. A morfologia característica de células B1 correlaciona-se com a evidência experimental indicating que os vasos sanguíneos / células endoteliais e ventriculares líquido cefalorraquidiano (LCR) constituem fontes reguladas de sinais solúveis que agem em NSCs 2,6,9-11. Na superfície ventricular, homotï¿½ica e interações APICO-lateral heterotípicos envolvendo células ependimárias e B1 incluem junções apertadas e junções aderentes 5,12. Além disso, as moléculas de adesão implicados nos complexos juncionais entre as células B1 e ependimais, tais como N-caderina e V-CAM, têm sido mostrados para regular não só o posicionamento altamente organizada de B1 no nicho V-SVZ, mas também a sua quiescência 12 , 13. A monocamada de células ependimária-B1 parece actuar como uma barreira de difusão, permitindo o fluxo regulado de água e pequenas moléculas a partir do CSF, mas restringindo a passagem de grandes proteínas intercelular 10,11. A evidência experimental indica que o cílio apical de células B1 singularmente posicionada poderia desempenhar um papel como um sensor de sinalização polipeptídeos presentes no CSF 2,5-7. Células ependimais são, por si só, também uma fonte de sinais solúveis e ligadas à membrana, com um papel na regulação do comportamento NSC 14,15. Rastreáveis ​​nucleósidos, tais como bromo-desoxiuridina (BrdU), ou retrovírus têm sido amplamente utilizados para marcar células progenitoras, incluindo as NSC, in vivo. No entanto, estes métodos não são ideais para o rastreio destino a longo prazo em virtude dos sinais de BrdU diluído através de divisões celulares utilizadas e retrovírus parecem ter como alvo, preferencialmente, de forma transiente células, devido à sua exigência de proliferação celular para a transdução 16,17 amplificar. Para examinar NSC fisiologia in vivo, incluindo interações com componentes de nicho, é fundamental estabelecer um método para rotular e rastrear células raramente se dividem, como B1-NSCs são em grande parte de repouso e as suas células ependimárias vizinhos Nunca dividir em condições fisiológicas 3. Aqui, mostramos que vetores de lentivírus (VEs) permitir a marca de gene de alta eficiênciação e modificação de longo prazo de NSC adultas e células ependimais que não se dividem, devido razoavelmente mais a sua capacidade para transduzir e a integrar-se no genoma das células alvo de um modo independente do ciclo celular. Além disso, mostramos como a rota de entrega e viral título de ajuda para transduzir especificamente células ependimárias, mas não células B1 permitindo assim a análise dos efeitos, ependimárias dependente de nicho no NSC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XL-100K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>358126</td>
			<td>25X89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326819</td>
			<td>13X51 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge adapters</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>358156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>PLC-30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>PLC-30024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>PLC-20101</td>
			<td>100x20 style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Afora</td>
			<td>DE400800</td>
			<td>12x75 mm, 5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cup sterile FACS filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>340626</td>
			<td>30 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>0.22 &#956;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>Blue laser 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter</td>
			<td>Biofil</td>
			<td>FPE-204-500&#160;</td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE plasmid&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12251</td>
			<td>Core packaging plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV.REV plasmid&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12253</td>
			<td>Core packaging plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2G plasmid&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td>Envelope plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12252</td>
			<td>Transfer vector plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0101-500</td>
			<td>For HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>For 293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,&#160; DNAse/RNAse-free, 0.2 &#181;m sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X HBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181B-500</td>
			<td>Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100</td>
			<td>Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458</td>
			<td>Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline&#160; (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde EM grade 16%</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.leicabiosystems.com/">Vernier stereotaxic instrument</a></td>
			<td>NeuroLab, Leica</td>
			<td>39463001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cunningham mouse and neonatal rat adaptor</td>
			<td>NeuroLab, Leica</td>
			<td>39462950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe holder</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS-311-CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>P/N&#160;&#160;&#160; 84851/00</td>
			<td>#85RN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric drill</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>98096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal blanket</td>
			<td>Ufesa</td>
			<td>AL5512/01</td>
			<td>230-240 V, 100-110 W, type C_AL01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver&#160;</td>
			<td>Jata</td>
			<td>MP373N</td>
			<td>Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Esteve</td>
			<td>DOMTOR&#160;</td>
			<td>Comercial solution at 1 mg/ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Merial</td>
			<td>Imalgene 500&#160;</td>
			<td>Comercial solution at 50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidina/ketamine mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>Torbugesic</td>
			<td>Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Esteve</td>
			<td>Antisedan</td>
			<td>Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% saline solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td>13465412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>Topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HydroGel</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34120</td>
			<td>11x21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach/Virkon</td>
			<td>Dupont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker pen</td>
			<td>Staedler</td>
			<td>313-9</td>
			<td>Permanent lumocolor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic lubricant &#160;</td>
			<td></td>
			<td>SICCAFLUID</td>
			<td>0.5 g/dosis, carbomer 974P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td>694109.6</td>
			<td>10% povidone-iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 3: Histological analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer Inst. Co.</td>
			<td>HV-07524-55</td>
			<td>Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump head</td>
			<td>Cole-Parmer Inst. Co.</td>
			<td>HV-07518-00</td>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tube</td>
			<td>Cole-Parmer Inst. Co.</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Platinum L/S 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalp vein set</td>
			<td>Vygon V-green</td>
			<td>70246.05T</td>
			<td>25G, 30 cm tube length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FluoView FV10i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Tehtnica</td>
			<td>SHP-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer (PB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141451.1211</td>
			<td>Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55&#8211;60 &#176;C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.9% NaCl in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>LOCTITE</td>
			<td>767547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>122712.1608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP rabbit antibody</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-401-215</td>
			<td>Use at a 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Use at a 1:750 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td>Mounting medium for fluorescent preparations</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stable and efficient genetic modification of cells in the adult mouse v-svz for the analysis of neural stem cell autonomous and non-autonomous effects

Relativamente células estaminais somáticas quiescentes apoiar a renovação celular ao longo da vida, na maioria dos tecidos adultos. As células estaminais neurais no cérebro de mamíferos adultos está restrita a dois nichos neurogénicos específicos: a zona subgranular do giro dentado no hipocampo e na zona ventricular-subventricular (V-SVZ; também denominada zona subependimal ou SEZ) nas paredes das laterais ventrículos. O desenvolvimento de estratégias de transferência in vivo de genes para as populações de células estaminais adultas (isto é, as do cérebro de mamíferos), resultando em expressão a longo termo de transgenes desejados nas células-tronco e a sua descendência resultante é uma ferramenta importante na investigação biomédica e biotecnológica corrente. Aqui, um método direto in vivo é apresentado para a modificação genética estável de células do rato adulto V-SVZ que se aproveita da infecção independente do ciclo celular por LVs ea citoarquitetura altamente especializada do nicho V-SVZ. Especificamente, o protocolo atual envolvems a injecção do LVS vazio (controlo) ou LVs que codificam as cassetes de expressão de transgenes específica para qualquer um do próprio V-SVZ, para o direccionamento in vivo de todos os tipos de células no nicho, ou para o lúmen do ventrículo lateral, para o direccionamento de ependimária células única. As cassetes de expressão são, em seguida, integrado no genoma das células transduzidas e proteínas fluorescentes, também codificados pelo LVS permitir a detecção das células transduzidas para a análise dos efeitos dependentes do nicho de células autónomos e não autónomos, em células marcadas e os seus progênie.

Sistema de entrega de genes mediada por LV pode ser utilizado para a longo prazo na transdução in vivo de células do ratinho adulto V-SVZ, permitindo que o seu controle e modificação genética durante a proliferação, a migração ea diferenciação. A infecção e a expressão são altamente eficazes e produzem numerosas células que podem ser facilmente distinguidos entre outras células não-infectadas por a expressão do repórter incluídos. Temos, assim, muito visualizado células transduzidas com G...

Watch this Scientific Journal Video about Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects at JoVE

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

The overall goal of this procedure is to deliver low volumes of high titer lentiviral particles carrying specific DNA constructs to the adult mouse ventricular-subventricular zone to infect all of its cell types or to the lateral ventricle to affect ependymal cells only.This method can help answer key questions about interactions that neural stem cells of the adult ventricular-subventricular niche have with their neighboring ependymal cells.The main advantage of this technique is that lentiviral vectors integrate into the genome of target cells in a cell cycle independent way, allowing for long-term diffication of rarely dividing cells.Helping me to demonstrate the procedure will be grad student Beatriz Mart

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Biologia do Desenvolvimento

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

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In Vitro Crescimento do folículo pré-antral do Mouse sob microgravidade simulado

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Modelo de impacto cortical controlado da lesão cerebral do rato com transplantação terapêutica de células neurais pluripotentes induzidas humanas da pilha de haste

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Dissecção, cultura e análise de células da crista neural craniana primária do mouse para o estudo de delaminação e migração de células de crista neural

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...