Name: isolation of viral replication compartment-enriched sub-nuclear fractions from adenovirus-infected normal human cells
Uploaded: 2015-11-12T14:00:00
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This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).

1. HFF सेल संस्कृति और विज्ञापन-संक्रमण <ol><li> पहले 8 के रूप में वर्णित HFF कोशिकाओं पर फ्लोरोसेंट गठन इकाइयों (FFU) के रूप में HEK 293 कोशिकाओं और अनुमापांक के monolayers में AD5 गुम्मट वायरस प्रचार। </li><li> एक humidified इनक्यूबेट?...

<ol>
	<li>Doucas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+replication+is+coupled+with+the+dynamic+properties+of+the+PML+nuclear+structure.">Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure.</a> Genes &#38; Dev. 10, 196-207 (1996).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).</li><li>Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+viral+replication+complexes.">Cytoplasmic viral replication complexes.</a> Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).</li><li>Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+characterization+of+the+membranous+hepatitis+C+virus+replication+compartment.">Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment.</a> J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).</li><li>Busch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Nucleoli.">Isolation of Nucleoli.</a> Exp Cell Res. 24, 150-163 (1963).</li><li>Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+isolation+of+Cajal+bodies+from+HeLa+cells.">Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).</li><li>Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolus.">The nucleolus.</a> J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).</li><li>Groitl, P., Dobner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+adenovirus+type+5+early+region+1+and+4+virus+mutants.">Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants.</a> Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).</li><li>Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+which+recognize+native+and+denatured+forms+of+the+adenovirus+DNA-binding+protein.">Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein.</a> Virology. 128, 480-484 (1983).</li><li>Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+on+adenovirus+late+gene+expression+of+deleting+the+E1b+55K+protein.">Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).</li><li>Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E1B+55-kilodalton+protein+is+required+for+both+regulation+of+mRNA+export+and+efficient+entry+into+the+late+phase+of+infection+in+normal+human+fibroblasts.">Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts.</a> J. Virol. 80, 964-974 (2006).</li><li>Castillo-Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mre11+Cellular+Protein+Is+Modified+by+Conjugation+of+Both+SUMO-1+and+SUMO-2/3+during+Adenovirus+Infection.">The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection.</a> ISRN Virology. 2014, 14 (2014).</li><li>Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+late-phase+infection+is+controlled+by+a+novel+L4+promoter.">Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter.</a> J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).</li><li>Wright, J., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+adenovirus+5+L4+promoter+is+activated+by+cellular+stress+response+protein+p53.">The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53.</a> J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).</li></ol>

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th...

Adenoviruses संक्रमित कोशिका के नाभिक में replicates एक डबल असहाय डीएनए जीनोम होते हैं। वायरल डीएनए नाभिक में प्रवेश करती है, यह पीएमएल परमाणु निकायों 1 से सटे localizes। वायरल जल्दी जीन अभिव्यक्ति के बाद परमाणु वास्तुकला नाटकीय रूप से कहा जाता है, वायरल microenvironments के गठन के उत्प्रेरण, पुनर्गठित किया है वायरल प्रतिकृति डिब्बों (आरसी) 2। एडीनोवायरस (विज्ञापन) आर सी वायरल जीनोम प्रतिकृति और वायरल देर जीनों की अभिव्यक्ति जगह ले जहां साइटों रहे हैं, वे इन प्रक्रियाओं में भाग लेने कि सभी आवश्यक वायरल और सेलुलर कारकों की भर्ती के लिए एक वातावरण प्रदान करते हैं। दिलचस्प है, इस तरह के डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया के रूप में सेलुलर एंटीवायरल प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार सेलुलर प्रोटीन की एक किस्म, सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ट्यूमर दमन सहयोजित इन वायरल साइटों से 2 हैं। समन्वित रूप से विनियमित करने, जबकि कुशल वायरल प्रतिकृति को बढ़ावा देने कि इसलिए, विज्ञापन आरसी माना जा सकता है विनियामक केन्द्रोंइन संरचनाओं वायरस मेजबान सेल बातचीत की समझ के लिए महत्वपूर्ण हैं यह दर्शाता है कि सेलुलर एंटीवायरल प्रतिक्रिया,। फिर भी, आर सी के गठन के आणविक तंत्र, उनकी संरचना और संबद्ध गतिविधियों खराब समझ रहे हैं। नाभिक में दोहराने कि अन्य डीएनए वायरस से adenoviral आरसी, साथ ही आर सी साइटोप्लास्मिक आर सी 3 के विपरीत, झिल्ली के लिए नहीं जुड़े रहे हैं। इसके अलावा, इन वायरस प्रेरित संरचनाओं प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की पूरी तरह से बना होने की संभावना है। आरएनए वायरस से संक्रमित कोशिकाओं में गठित आर सी अपने विस्तृत रूपात्मक, कार्यात्मक और जैव रासायनिक लक्षण वर्णन 4 में मदद की है, जो उनके साइटोप्लास्मिक स्थानीयकरण और झिल्ली बाध्य स्थिति का लाभ लेने, पृथक किया गया है (आमतौर पर वायरल कारखानों कहा जाता है)। हमारे ज्ञान करने के लिए, परमाणु वायरल आर सी शायद कारण intranuclear मीटर की परमाणु वास्तुकला और अभाव की जटिलता के लिए, अलग-थलग नहीं किया गया हैउनके अलगाव की सुविधा होगी कि embranes। उनके अध्ययन के बजाय immunofluorescence माइक्रोस्कोपी, मछली और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पर भरोसा है। हालांकि, subnuclear संरचनाओं को अलग-थलग करने के लिए निहित जटिलताओं के बावजूद इस तरह के nucleoli और Cajal निकायों के रूप में अन्य परमाणु डोमेन 5,6 से पहले अलग-थलग कर दिया गया है। Nucleoli और आर सी दोनों प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड से बना है, और 0.5 के बीच एक व्यास कर रहे हैं के बाद से - 5 माइक्रोन, हम आर सी भी अलगाव के लिए उत्तरदायी होना चाहिए कि धारणा। इसलिए, और अधिक ठीक आर सी के लिए जुड़े आणविक संरचना और कार्यों को चिह्नित करने के क्रम में, हम आर सी के साथ समृद्ध subnuclear अंशों को अलग-थलग करने के लिए एक उपन्यास विधि की स्थापना की। यह अंत करने के लिए, हम nucleoli 7 या अन्य परमाणु डोमेन के 6 अलग करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं के समान वेग ढ़ाल और सुक्रोज तकिये का उपयोग करके उप-परमाणु अंशों तैयार किया है और आणविक संरचना के अध्ययन और संबंधित गतिविधियों की अनुमति देता है कि एक सेल मुक्त प्रणाली की स्थापनाआर सी। इस तकनीक को इसलिए वायरस मेजबान सेल बातचीत की समझ अग्रिम और भी नाभिक में दोहराने कि अन्य वायरस से आर सी का विस्तृत विश्लेषण की सुविधा और adenovirus- में गठन उन लोगों के लिए इसी तरह के आयामों की प्रतिकृति डिब्बों के गठन को प्रेरित करना चाहिए कि एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करना चाहिए इस तरह, herpesviruses, papillomaviruses या polyomaviruses के रूप में संक्रमित कोशिकाओं,।

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td>Warm in 37 &#186;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12484-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, Ultra Pure</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>0928S</td>
			<td>Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 &#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Kontess Glass Company</td>
			<td>884900-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Z769533&#160;SIGMA</td>
			<td>Turn on 15 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-003</td>
			<td>Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>Use at a 1:2,000 dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4651-72EA</td>
			<td>Open in a laminar flow cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Pierce ThermoScientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viral replication compartment-enriched sub-nuclear fractions from adenovirus-infected normal human cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

वायरल प्रतिकृति डिब्बों (आर सी) प्रोटीन और अन्य परमाणु डोमेन के लिए समान न्यूक्लिक एसिड से बना subnuclear वायरल प्रेरित संरचनाओं हैं, वे जैव रासायनिक विशेषताओं के आधार पर वेग ढ़ाल से अलगाव के लिए उत्तरदायी स?...

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Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Adenovirus संक्रमित सामान्य मानव कोशिकाओं से वायरल प्रतिकृति कम्पार्टमेंट समृद्ध उप-परमाणु भागों का अलगाव

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

फिडेलिटी और वायरस वायरस उत्परिवर्तन आवृत्ति के शाही सेना के विशेषता के वेरिएंट के अलगाव

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

वायरल डीएनए के Nucleocapsids से तैयार

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Polarized मानव airway के एक तरल से ढके संस्कृति की स्थापना उपकला Calu 3 मेजबान सेल श्वसन रोगज़नक़ों रिस्पांस कोशिकाओं के अध्ययन<em&gt; इन विट्रो में</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

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In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

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The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

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Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

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