Name: isolation of viral replication compartment-enriched sub-nuclear fractions from adenovirus-infected normal human cells
Uploaded: 2015-11-12T14:00:00
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This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).

1. HFF 세포 배양 및 광고 감염 <ol><li> 앞서 설명 된 바와 같이 8 HFF 세포에 형광 형성 유닛 (FFU)로서 HEK-293 세포의 단층에서 역가의 Ad5 WT 바이러스를 전파. </li><li> 가습 인큐베이터에서 DMEM / 10 % 태아 소 37 ºC에서 멸균 문화 100mm 요리 혈청 (FBS) 5 % CO 2 10ml에 인간의 포피 섬유 아세포 (HFF)을 성장. 네 16 평방 세트에서 세포를 계산하여 노이 바 우어 챔버를 이용하여 세포 수를 결정합니...

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	<li>Doucas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+replication+is+coupled+with+the+dynamic+properties+of+the+PML+nuclear+structure.">Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure.</a> Genes &#38; Dev. 10, 196-207 (1996).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).</li><li>Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+viral+replication+complexes.">Cytoplasmic viral replication complexes.</a> Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).</li><li>Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+characterization+of+the+membranous+hepatitis+C+virus+replication+compartment.">Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment.</a> J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).</li><li>Busch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Nucleoli.">Isolation of Nucleoli.</a> Exp Cell Res. 24, 150-163 (1963).</li><li>Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+isolation+of+Cajal+bodies+from+HeLa+cells.">Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).</li><li>Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolus.">The nucleolus.</a> J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).</li><li>Groitl, P., Dobner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+adenovirus+type+5+early+region+1+and+4+virus+mutants.">Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants.</a> Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).</li><li>Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+which+recognize+native+and+denatured+forms+of+the+adenovirus+DNA-binding+protein.">Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein.</a> Virology. 128, 480-484 (1983).</li><li>Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+on+adenovirus+late+gene+expression+of+deleting+the+E1b+55K+protein.">Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).</li><li>Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E1B+55-kilodalton+protein+is+required+for+both+regulation+of+mRNA+export+and+efficient+entry+into+the+late+phase+of+infection+in+normal+human+fibroblasts.">Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts.</a> J. Virol. 80, 964-974 (2006).</li><li>Castillo-Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mre11+Cellular+Protein+Is+Modified+by+Conjugation+of+Both+SUMO-1+and+SUMO-2/3+during+Adenovirus+Infection.">The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection.</a> ISRN Virology. 2014, 14 (2014).</li><li>Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+late-phase+infection+is+controlled+by+a+novel+L4+promoter.">Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter.</a> J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).</li><li>Wright, J., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+adenovirus+5+L4+promoter+is+activated+by+cellular+stress+response+protein+p53.">The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53.</a> J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).</li></ol>

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th...

아데노 바이러스는 감염된 세포의 핵에서 복제하는 이중 가닥 DNA 게놈을 포함합니다. 바이러스의 DNA는 핵 진입하면 PML 핵 몸체 (1)에 인접하여 국소화. 바이러스 초기 유전자 발현 다음, 핵 구조는 과장 되나, 바이러스 성 미세 환경의 형성을 유도하는, 재구성 바이러스 복제 격실 (RC) 2. 아데노 바이러스 (AD) RC는 바이러스 게놈의 복제 및 바이러스 유전자의 발현 늦은이 일어나는 부위이기 때문에, 이들은 이러한 프로세스에 참여하는 모든 필요한 바이러스 및 세포 인자의 채용을위한 환경을 제공한다. 흥미롭게도, 이러한 DNA 손상 반응으로서 세포의 항 바이러스 반응을 담당 세포 단백질의 다양성은 선천성 면역 반응 및 종양 억제는 공동하기로 이들 바이러스 2 위치한다. 병용을 조절하면서 효율적인 바이러스 복제를 촉진 따라서, 광고 RC가 고려 될 수 규제 허브이러한 구조는 바이러스 숙주 세포 상호 작용의 이해에 중요한 것을 나타내는 응답 세포 바이러스. 그럼에도 불구하고, RC 형성의 분자 메커니즘은 그들의 조성과 연관된 활동을 제대로 이해된다. 핵에서 복제 다른 DNA 바이러스에서 아데노 바이러스 RC뿐만 아니라 RC는 세포질 RC 3 대조적으로, 막에 관련되지 않습니다. 또한, 이러한 바이러스 - 유도 구조 단백질 및 핵산의 전체 구성 될 가능성이 높다. RNA 바이러스에 감염된 세포에서 형성 RC는 상세한 형태 적, 기능적, 생화학 적 특성 (4)를 촉진했다 그들의 세포질 현지화 및 막 - 결합 상태, 활용, 고립 된 (일반적으로 바이러스 성 공장을 지칭). 우리의 지식에, 핵 바이러스 성 RC는 아마도 인해 핵내 M의 핵 구조와 부재의 복잡성, 격리되지 않은자신의 분리를 용이하게 할 embranes. 이들의 연구는 대신에 면역 형광 현미경, 생선, 투과 전자 현미경에 의존하고있다. 그러나 subnuclear 구조를 분리 고유의 합병증에도 불구하고, 이러한 핵소체와 Cajal 기관과 같은 다른 핵 도메인은 5,6 전에 격리되었다. 핵소체 및 RC는 모두 단백질 및 핵산으로 구성하고, 직경이 0.5이되기 때문에 - 5 ㎛, 우리는 RC 역시 의무가 분리되어야한다는 가설을 세웠다. 따라서,보다 정확하게 RC 연관된 분자 조성 및 기능을 특성화하기 위해, 우리는 RC subnuclear 풍부 분획을 분리하는 새로운 방법을 확립. 이를 위해 핵소체 7 또는 다른 핵 영역 (6)을 분리하기 위해 사용 된 절차와 유사한 속도 구배 및 수 크로스 쿠션을 사용하는 하위 핵 분획을 제조하고, 분자 조성물의 연구 및 연관된 활동을 가능하게하는 무 세포계를 설립RC. 이 기술은 따라서 바이러스 숙주 세포 상호 작용의 이해를 발전하고 또한 핵 복제 다른 바이러스로부터 RC의 상세한 분석을 용이하게하고 adenovirus- 형성과 동일한 치수의 복제 구획 형성을 유도한다 강력한 도구를 대표한다 예, 헤르페스 바이러스, 유두종 바이러스 또는 폴리오 마 감염된 세포.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td>Warm in 37 &#186;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12484-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, Ultra Pure</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>0928S</td>
			<td>Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 &#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Kontess Glass Company</td>
			<td>884900-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Z769533&#160;SIGMA</td>
			<td>Turn on 15 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-003</td>
			<td>Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>Use at a 1:2,000 dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4651-72EA</td>
			<td>Open in a laminar flow cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Pierce ThermoScientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viral replication compartment-enriched sub-nuclear fractions from adenovirus-infected normal human cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

바이러스 복제 용 구획 (RC)는 단백질과 다른 핵 도메인 유사한 핵산 이루어지는 subnuclear 바이러스 - 유도 된 구조이기 때문에, 그들은 생화학 적 특징에 기초하여 속도 구배에 의해 분리 의무가 것을 알았다. 분별 프로토콜의 중요한 단계는 샘플이 다른 서브 세포 분획의 무결성을 보장하기 위해 명 시야 현미경으로 관찰 할 필요가 각 단계에서,도 1에 도시되어있다. 세포를 팽창 할 때...

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Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

연구

면역학 및 감염병학

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Jsubtomo을 사용하여 전자 Cryotomography 재건에서 바이러스 성 봉투 ​​당 단백질 스파이크의 평균화

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

쥐 고환의 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리 및 세뇨관 세포

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...