Name: isolation of viral replication compartment-enriched sub-nuclear fractions from adenovirus-infected normal human cells
Uploaded: 2015-11-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells at JoVE.com

This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).

1. HFF Cell Culture och Ad-infektion <ol><li> Propagera Ad5 WT virus i monoskikt av HEK-293-celler och titer som fluorescerande bildande enheter (FFU) på HFF-celler som beskrivits tidigare 8. </li><li> Grow humana förhudsfibroblaster (HFF) i 10 ml DMEM / 10% fetalt bovint serum (FBS) i sterila kultur 100 mm skålar vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator. Bestäm mobilnummer med hjälp av en Neubauer kammare genom att räkna celler i de fyra 16-kvadratiska uppsättningar. Cellantalet per m...

<ol>
	<li>Doucas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+replication+is+coupled+with+the+dynamic+properties+of+the+PML+nuclear+structure.">Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure.</a> Genes &#38; Dev. 10, 196-207 (1996).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).</li><li>Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+viral+replication+complexes.">Cytoplasmic viral replication complexes.</a> Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).</li><li>Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+characterization+of+the+membranous+hepatitis+C+virus+replication+compartment.">Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment.</a> J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).</li><li>Busch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Nucleoli.">Isolation of Nucleoli.</a> Exp Cell Res. 24, 150-163 (1963).</li><li>Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+isolation+of+Cajal+bodies+from+HeLa+cells.">Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).</li><li>Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolus.">The nucleolus.</a> J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).</li><li>Groitl, P., Dobner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+adenovirus+type+5+early+region+1+and+4+virus+mutants.">Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants.</a> Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).</li><li>Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+which+recognize+native+and+denatured+forms+of+the+adenovirus+DNA-binding+protein.">Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein.</a> Virology. 128, 480-484 (1983).</li><li>Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+on+adenovirus+late+gene+expression+of+deleting+the+E1b+55K+protein.">Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).</li><li>Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E1B+55-kilodalton+protein+is+required+for+both+regulation+of+mRNA+export+and+efficient+entry+into+the+late+phase+of+infection+in+normal+human+fibroblasts.">Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts.</a> J. Virol. 80, 964-974 (2006).</li><li>Castillo-Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mre11+Cellular+Protein+Is+Modified+by+Conjugation+of+Both+SUMO-1+and+SUMO-2/3+during+Adenovirus+Infection.">The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection.</a> ISRN Virology. 2014, 14 (2014).</li><li>Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+late-phase+infection+is+controlled+by+a+novel+L4+promoter.">Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter.</a> J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).</li><li>Wright, J., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+adenovirus+5+L4+promoter+is+activated+by+cellular+stress+response+protein+p53.">The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53.</a> J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).</li></ol>

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th...

Adenovirus innehåller ett dubbelsträngat DNA-genom som replikerar i den infekterade cellkärnan. När viralt DNA in i kärnan, lokaliserar det i anslutning till PML nukleära organ 1. Efter viral tidigt genuttryck, är kärn arkitekturen dramatiskt omorganiseras, inducera bildning av virala mikromiljöer, kallas virusreplikation Fack (RC) 2. Eftersom adenovirus (Ad) RC är platser där virusgenom replikation och uttryck av virala sena gener sker, de ger en miljö för rekrytering av alla nödvändiga virala och cellulära faktorer som deltar i dessa processer. Intressant, en mängd olika cellulära proteiner som är ansvariga för det cellulära antivirala svaret, såsom DNA-skada svaret, det medfödda immunförsvaret och tumörsuppression är adjungerad till dessa virus platser 2. Därför kan Ad RC anses regel nav som främjar en effektiv virusreplikation medan samtidigt regleracellulär antiviralt svar, vilket indikerar att dessa strukturer är nyckeln till förståelsen av virusvärdcellinteraktioner. Ändå, de molekylära mekanismerna för RC bildning, deras sammansättning och därmed förenlig verksamhet är dåligt förstådd. Adenoviral RC, samt RC från andra DNA-virus som replikerar i kärnan är inte förknippade till membran, i motsats till cytoplasmisk RC 3. Dessutom är dessa virusinducerade strukturerna sannolikt kommer att helt bestå av proteiner och nukleinsyror. RC bildas i celler infekterade med RNA-virus (brukar benämnas virusfabriker) har isolerats, att dra nytta av deras cytoplasmiska lokalisering och membranbundna status, vilket har underlättat deras detaljerade morfologiska, funktionella och biokemisk karakterisering 4. Såvitt vi vet, har kärn viral RC inte isolerats, kanske på grund av komplexiteten i kärn arkitektur och frånvaro av intranukleär membranes som skulle underlätta deras isolering. Deras studie har förlitat sig i stället på immunfluorescensmikroskopi, FISH och transmissionselektronmikroskop. Trots komplikationer inneboende isolera subnukleära strukturer, andra kärnområden såsom nukleoler och Cajal organ har isolerats före 5,6. Eftersom nukleoler och RC är båda består av proteiner och nukleinsyror, och har en diameter mellan 0,5 till 5 pm, hypotes vi att RC också bör vara möjligt att isolering. Därför, för att mer exakt karakterisera den molekylära sammansättning och funktioner associerade till RC har vi etablerat en ny metod för att isolera subnukleära fraktioner berikade med fjärrstyrning. För detta ändamål, beredda vi under nukleära fraktioner med hjälp hastighetsgradienter och sackaros kuddar liknande metoder som används för att isolera nukleolerna 7 eller andra kärnområden 6 och etablerade ett cellfritt system som tillåter studiet av molekylära sammansättning och tillhörande verksamhetRC. Denna teknik bör därför utveckla förståelsen av virus-värdcellinteraktioner och representerar ett kraftfullt verktyg som även bör underlätta detaljerad analys av RC från andra virus som replikerar i kärnan och inducera bildning av replikationsutrymmena i liknande dimensioner till de som bildas i adenovirus- infekterade-celler, såsom, herpesvirus, papillomavirus eller polyomavirus.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td>Warm in 37 &#186;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12484-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, Ultra Pure</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>0928S</td>
			<td>Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 &#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Kontess Glass Company</td>
			<td>884900-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Z769533&#160;SIGMA</td>
			<td>Turn on 15 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-003</td>
			<td>Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>Use at a 1:2,000 dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4651-72EA</td>
			<td>Open in a laminar flow cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Pierce ThermoScientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viral replication compartment-enriched sub-nuclear fractions from adenovirus-infected normal human cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

Eftersom virusreplikation fack (RC) är subnukleära virusinducerad strukturer bestående av proteiner och nukleinsyror, som liknar andra kärnområden, visade de att vara mottagliga för isolering genom hastighetsgradienter baserade på biokemiska funktioner. Kritiska steg i fraktioneprotokoll illustreras i fig 1. Vid varje steg proverna måste övervakas genom ljusfältsmikroskopi att säkerställa integriteten hos de olika subcellulära fraktioner. Till exempel, när svullnad cellerna, inkubationstid...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells at JoVE.com

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Isolering av Viral Replication Fack-berikade underkärn Fraktioner från adenovirus-infekterade Normal humana celler

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Beredning av viral DNA från Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Medelvärdes av Viral höljesglykoproteinet Spikes från Electron Cryotomography rekonstruktioner använder Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering av leukocyter från Human Maternal-foster Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolering av Sertoliceller och peritubulär Celler från Rat Testiklar

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Pinnurvalsmetoden för påvisande av humana Norovirus på ytor

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Isolering av dendritiska celler från mänskliga kvinnliga fortplantningsorganen för fenotypiska och funktionella studier

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Isolering, Expansion och adipogena induktion av CD34 + CD31 + Endothelial celler från mänskliga Omental och subkutan fettvävnad

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...