Name: imaging neutrophils and monocytes in mesenteric veins by intravital microscopy on anaesthetized mice in real time
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time at JoVE.com

This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

注：動物の手順は、スイスのジュネーブで動物ケアの機関倫理委員会、州立獣医事務所に基づいて行われました。認証番号GE / 14分の63。 骨髄からの単一細胞懸濁液の調製<ol><li>頸椎脱臼により犠牲マウス（8〜12週齢）。 70％エタノールで後ろ足を滅菌します。後ろ足から肌を削除します。 </li><li>マウスの大腿骨と脛骨を解剖し、メスで脚から組織を除去します。 PBSで?...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaching+multiple+barriers:+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium.">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues.">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.+Intravital+microscopic+investigation+of+leukocyte+interactions+with+the+blood+vessel+wall.">Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall.</a> Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).</li><li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro.">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+blood+vessels+and+tissues+by+a+population+of+monocytes+with+patrolling+behavior.">Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior.</a> Science. 317, 666-670 (2007).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33, 375-386 (2010).</li><li>Hanna, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+NR4A1+(Nur77)+controls+bone+marrow+differentiation+and+the+survival+of+Ly6C-+monocytes.">The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes.</a> Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule+JAM-C+regulates+polarized+transendothelial+migration+of+neutrophils+in+vivo.">The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo.</a> Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).</li><li>Proebstl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+support+neutrophil+subendothelial+cell+crawling+and+breaching+of+venular+walls+in+vivo.">Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo.</a> J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).</li><li>Wantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+cathelicidin+promotes+adhesion+of+classical+monocytes.">Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes.</a> Circ Res. 112, 792-801 (2013).</li><li>Ozinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+for+pattern+recognition+of+pathogens+by+the+innate+immune+system+is+defined+by+cooperation+between+toll-like+receptors.">The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498, 371-375 (2013).</li><li>Carlin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nr4a1-dependent+Ly6C(low)+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal.">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li><li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo.">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo.">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109 (2011).</li></ol>

この原稿に記載された方法論は、効率的に定常状態および炎症状態下腸間膜静脈に単球および好中球の挙動を研究するための一貫したアプローチを提供します。 準備の重要なステップは、PBSで湿っ組織と腸の固定化です。正しく実行した場合、腸間膜血管がうまく画像取得のためのカバースリップ上に露出されています。これは、腸間膜静脈の白血球の挙動を監視する?...

<html>好中球および単球は、継続的に血液中を循環自然免疫系の細胞です。傷害または感染すると、炎症性シグナルは、ここで、細胞性免疫応答1-3を開始し 、破損して感染した組織への白血球の漏出を誘導します。白血球動員の迅速性は、免疫応答の肯定的な結果を決定します。これらの複雑なプロセスは、白血球に関与する分子の洞察を得る.TO循環白血球と内皮1-3との間の接着の連絡先を確立するために役立つ炎症を起こした内皮に存在する特定の分子（例えば、セレクチン、内皮に結合したケモカイン）に依存しています採用カスケードは、細胞動員の動態を可視化するために、各セル/集団の挙動を追跡することが重要です。効果的な方法は、目的の細胞内で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスに生体顕微鏡を含みます。 現在までの内容は&quot;&gt;、生体顕微鏡を用いて、いくつかの方法が画像に開発された血管系4,5。例えば、耳の真皮の血管系や生体共焦点顕微鏡による腸間膜静脈の撮像は、マウスLy6C 低い単球および人間のパトロール動作を識別するために使用されましたCD14は、定常状態条件6~8の下の血管の管腔表面上のCD16 +単球を暗く。マウス精巣挙血管系モデルは、多くの場合、トランスジェニックマウスにおける炎症性または虚血状態下での好中球または炎症Ly6C 高い単球の挙動を監視するために使用される。それは場合、精巣挙がIL1β、CCL2、TNFβまたはfMLPのの陰嚢内注射を介して刺激される。2-4時間後、組織はその後、外科的に露出されており、生体共焦点顕微鏡9-11で分析しました。 以下のプロトコルは、任意のと同時に、単球および好中球を監視するための方法を記載倒立蛍光共焦点顕微鏡。また、私たちの方法は、白血球動員の動態を追跡するためにどのように前の画像と同じ容器を（定常状態）にし、炎症後及び方法について説明します。この目的のために、我々は、その単球のeGFPを発現し、IVオレンジ色素で標識されたマウスの好中球を注射されたCX 3 CR1 GFP /重量マウスを使用しています。倒立共焦点顕微鏡を使用して、（1）追跡し、定常状態と、（2）局所炎症後の同じ容器の両方の単球および好中球の動員を追跡する下パトロールLy6C 低い単球を分析することが可能です。ここでは、Pam3CSK4 12 TLR2 / TLR1アゴニストを使用して炎症状態を作成します。また、このような撮像は、特定のノックアウトマウスまたは遮断抗体6,9,13の存在下で実行した場合の白血球動員カスケードの様々な段階での関心の特定の分子の役割を決定するのに役立つことがあります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tubes&#160;</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&#160;&#160; DT:4mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75&#160;&#160; DT:1mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Orange CMRA Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>19762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil Type A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>any viscous oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Life Box Temperature Control System</td>
			<td>Life Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R</td>
			<td>inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol red free DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>any phenol red free medium is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAM3CSK4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>reconstitute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture dish 100</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neutrophils and monocytes in mesenteric veins by intravital microscopy on anaesthetized mice in real time

効率的な免疫応答は、感染または傷害の部位への血液の白血球の急速な動員に依存しています。 in vivoでの白血球遊走を調査することは、血管内皮と白血球の経内皮遊走との相互作用の分子基盤を理解するために重要です。一つの強力なアプローチは、目的の細胞に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスの生体顕微鏡を必要とします。 ここでは、倒立型共焦点顕微鏡でオレンジ色の色素で標識された好中球を注射されたCX 3 CR1 GFP /重量マウス静脈撮像単球および好中球のためのプロトコルを提示します。タイムラプスムービーが両方の定常状態および炎症状態下腸間膜静脈の白血球の挙動の分析を可能にする画像の数時間に30分から集められました。ローカルTLR2 / TLR1アゴニストPam3SK4と血管の炎症を誘導し、subsequeを監視するために、我々はまた、手順を説明します好中球および単球のNT募集。 提示された技術はまた、白血球の他の集団を監視し、他の刺激またはトランスジェニックマウスを用いて白血球動員または輸送に関与する分子を調査するために使用することができます。

原稿を簡単にリアルタイムで麻酔したマウスの腸間膜静脈内単球および好中球の挙動を監視するために最適化されたプロトコルを記述します。 37°C-サーモスタット室の使用は、マウスの温度を維持し、また、白血球の温度依存移動によることが必須です。マウスの作製は、 図1、図2に示す顕微鏡で見たすべての領域に表示されます。透過光は、腸間膜静脈（赤矢印）と動脈（青?...

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Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Research

JoVE Journal

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