Name: bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the arabidopsis thaliana-pseudomonas syringae pathosystem
Uploaded: 2015-10-01T13:00:00
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We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.

Le texte qui suit décrit un protocole par étapes à accomplir optimisé Psm ES4326 dosage seringue d&#39;infiltration chez Arabidopsis. Les principales méthodes de ce test sont représentés dans un organigramme simplifié (figure 1). 1. Plante conditions de croissance <ol><li> Semer des graines <ol><li> Préparez 2 pots (4 de diamètre, 3,75 en hauteur) remplis sans tasser avec le sol et l&#39;eau des pots en les trempant du fond O / N avant de drainer l&#39;e...

Avec la diminution des terres agricoles disponibles et augmentation de la population, les chercheurs du monde entier sont mis au défi avec des besoins urgents pour l&#39;amélioration des cultures. Le rendement peut être grandement influencée par divers stress biotiques et abiotiques. Parmi eux, une infection pathogène est l&#39;une des principales causes de la baisse de rendement des cultures, responsable d&#39;environ 12% de pertes dans les États-Unis seuls 45. Pour résoudre ce problème, la recherche...

En raison de leur nature sessiles, les plantes sont constamment menacés par une pléthore d&#39;agents pathogènes présentant différents modes de vie et des stratégies nutritionnelles 1. En première approximation, les agents pathogènes biotrophes maintiennent leur hôte vivante pour récupérer les nutriments, tandis que les agents pathogènes et les toxines nécrotrophes enzymes activement secrets pour tuer le tissu hôte et se nourrissent sur ​​les cellules mortes 1. Un autre groupe d&#39;agents pathogènes, hemibiotrophs appelés, commence leur cours de l&#39;infection par le stade biotrophe et les changements à l&#39;étape nécrotrophe après avoir atteint un certain seuil de pathogène accumulation 2. Afin de se défendre efficacement contre ces micro-organismes, les plantes ont développé un système immunitaire inné compliquée équipé de mécanismes de surveillance multiples pour détecter l&#39;attaque d&#39;agents pathogènes et de déclencher localisée mort cellulaire programmée 3 ainsi que la résistance systémique acquise (SAR) 4. La recherche actuelle est axée sur la caractérisation de la sig essentielcomposants naling et croisées pourparlers dans le système immunitaire de la plante 5. Comme proposé dans le modèle &quot;Zig-Zag&quot; 5, la première couche de l&#39;usine de la réponse immunitaire innée nécessite la présence de plasma membrane localisée Motif Recognition Receptors (PRR) pour détecter l&#39;invasion d&#39;un microbe. PRR sont capables de reconnaître des modèles Microbe-Associated Molecular (MAMPS) et d&#39;établir l&#39;immunité MAMP-Triggered (MTI) 6. Outre induire une régulation positive de la transcription des gènes codant pour des protéines PR antimicrobiens 7, MTI conduit à une variété d&#39;événements qui arrête la croissance des pathogènes, y compris la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) et de l&#39;azote réactif espèces (RNS), le dépôt de callose à la paroi cellulaire ainsi que l&#39;activation de la signalisation de la kinase de multiples voies 8. Jusqu&#39;à présent, plusieurs MAMPS ont été identifiés pour déclencher MTI chez Arabidopsis, y compris Flg22 bactérienne 9 </sup&gt; (Un fragment d&#39;acide 22 aminés dérivée de la flagelline), 10 (18 elf18 acides aminés de la traduction bactérienne facteur d&#39;élongation Tu) et une pièce de structure de la paroi cellulaire 11 peptidoglycanes. Pour établir une infection réussie, certains agents pathogènes spécialisés ont évolué la capacité de protéines secrets virulence effectrices dans les espaces intracellulaires ou intercellulaires, et par conséquent réprimer MTI et de déclencher sensibilité effecteur-Triggered (ETS) 12,13. Par exemple, les effecteurs de virulence peuvent inactiver mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphorylation cascades de MTI pour induire le développement de la maladie dans le tissu infecté 14-16. Lors de la co-évolution dynamique entre hôtes et pathogènes, les plantes ont également développé la stratégie de contre-attaque de reconnaître les protéines effectrices et atténuer la virulence des agents pathogènes 17 molécules. Cette reconnaissance directe ou indirecte effecteur est médiée par la résistance aux maladies (R) 18 protéines. La plupart des tourlet sont membres de NB-LRR (Nucleotide Binding et riche en leucine répétitions) famille 19. La perception d&#39;un effecteur avirulent par une protéine R provoque une réponse immunitaire plus forte et plus large que l&#39;immunité caractérisé effecteur-Triggered (ETI) 20. Outre induire l&#39;expression de gènes de défense 21 et la production de métabolites de la défense 22, ETI conduit souvent à une mort rapide localisée cellulaire programmée connu comme réponse hypersensible (HR) pour restreindre l&#39;agent pathogène de se propager dans le tissu adjacent 3. En plus de l&#39;localisé mort cellulaire programmée 23, les plantes sont capables d&#39;initier une longue durée et la réponse immunitaire systémique appelée résistance systémique acquise (SAR) 4. Lors de l&#39;épreuve avec un agent pathogène biotrophe, les cellules végétales déclenchent la biosynthèse et l&#39;accumulation d&#39;un acide salicylique de phytohormone endogène (SA) et des protéines PR dans les deux tissus locaux et systémiques 24. Grâce à tsa démarche, un état ​​de préparation est réalisée dans les feuilles non infectées qui permet de monter des réponses plus rapides de la défense au cours d&#39;une infection ultérieure par un large spectre d&#39;agents pathogènes 24. SA et ses analogues synthétiques tels que le benzo (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioïque ester de l&#39;acide S-méthyl (BTH) et l&#39;acide 2,6-dichloro-isonicotinique (INA) sont capables d&#39;induire chimiquement l&#39;acide salicylique (SA) Immunité -Triggered (IST) à la demande externe 24. Nonexpressor de la pathogenèse-Les gènes associés (1 NPR1) est proposé pour être l&#39;un des récepteurs et des fonctions SA en tant que régulateur transcriptionnel majeur au cours de la réaction de défense SA-médiation dans les deux tissus locaux et systémiques 21,25,26. Il a été démontré de façon concluante que NPR1 est nécessaire à l&#39;établissement SAR et la perte de NPR1 mène à susceptibilité dramatique vers Pseudomonas syringae 25. Pour caractériser largement la contribution moléculaire de l&#39;usinecomposants dans les interactions plante-pathogène, de multiples essais biologiques ont été développés pour mesurer des événements spécifiques de la défense, y compris ROS éclatement 27, dépôt de callose 28, l&#39;expression des gènes de défense et l&#39;accumulation de leurs produits protéiques 21. Bien que ces dosages individuels peuvent fournir des indications sur une forme spécifique de la réponse immunitaire de la plante, aucun d&#39;entre eux, cependant, sont en mesure de représenter la réponse complète de la défense au niveau de la plante entière. A l&#39;inverse, la quantification de l&#39;évolution de l&#39;infection par l&#39;agent pathogène après fournit une estimation globale de la réponse immunitaire au niveau des organismal. Par conséquent, le développement et l&#39;optimisation d&#39;un test pathogène inoculation précis et hautement normalisé est essentiel pour alimenter la recherche et les découvertes sur les réponses immunitaires Arabidopsis. Pseudomonas syringae, une bactérie à Gram-négatif, a été identifié comme un phytopathogène capable de provoquer une maladie chez une gamme de plantes hôtes y compris Arabidopsest 29. Comme le système plante-pathogène modèle, Arabidopsis - P. interaction syringae a été largement appliqué à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents réponses végétales défense 29. Jusqu&#39;à maintenant, plus de 50 P. pathovars syringae ont été identifiés sur la base de leur capacité à infecter les 30 espèces végétales différentes . P. syringae pv. DC3000 de tomate (Pst DC3000) 31 et P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 sont les deux souches virulentes plus largement utilisés et largement caractérisés. En plus d&#39;être reconnu par la plante et le déclenchement de la réponse MTI, Pst DC3000 et PSM ES4326 sont capables de sécréter des protéines effectrices virulentes de supprimer MTI et de déclencher ETS de favoriser la croissance de 31,33 pathogène. Pour disséquer fonctionnellement l&#39;interaction entre Arabidopsis et P. syringae, multiple0; méthodes d&#39;infection des agents pathogènes ont été développés sur la base de l&#39;approche de prestation des agents pathogènes. Pour les plantes des sols cultivés, agent pathogène peut être délivré par la seringue infiltration, infiltration sous vide, dip inoculation et inoculation par pulvérisation 29,34. Récemment, des semis dosage inondations inoculation a été développé pour effectuer des écrans de grande envergure sur la culture de tissus plaques cultivés jeunes plants d&#39;Arabidopsis 35. Seringue infiltration, comme l&#39;un de l&#39;approche la plus couramment utilisée, délivre manuellement l&#39;agent pathogène dans le apoplaste à travers les ouvertures de la feuille naturelle appelés stomates 29. Grâce à cette approche, des quantités égales de P. syringae peut être infiltré dans la feuille infectée et la force de la réponse immunitaire de la plante est inversement corrélée aux niveaux de croissance des agents pathogènes. Par conséquent, la quantification de la croissance de l&#39;agent pathogène sert une approche optimale pour évaluer la fonction immunitaire au niveau de la plante entière. En outre, une seringue infiltration peut distinguer le tissu local et systémique, qui peut be applicable à caractériser les mécanismes moléculaires sous-jacents SAR 36. Dans le protocole suivant, nous décrivons une seringue infiltration dosage optimisé avec Psm ES4326 pour cribler des mutants d&#39;Arabidopsis pour une meilleure sensibilité à la maladie (EDS). Ce protocole consiste à employer deux génotypes d&#39;Arabidopsis: une de type sauvage écotype Columbia-0 (Col-0) plantes (contrôle) et des mutants npr1-1 perte de fonction (hypersensible) qui seront infectés avec la souche bactérienne virulente Psm ES4326 37. Le mutant npr1-1 porte une mutation ponctuelle dans la séquence consensus de répétition ankyrine-NPR1 de la molécule, ce qui modifie l&#39;histidine hautement conservé de tyrosine et rend la protéine non fonctionnelle 25. En outre, un certain nombre de modifications de la seringue de dosage infiltration sont décrits qui permettent la quantification des défauts dans les couches spécifiques de la réponse immunitaire, y compris MTI et IST.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MetroMix 360&#160;</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>SNGMM360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large pots</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>TEKUVCC10TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x6 Inserts</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11x21 Flats with no holes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11x21 Flats with holes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1020H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl propagation domes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>CW-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0122-17-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>151946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>SB0494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150x15mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R80150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-450&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Hexahydrate</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>MB0328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>MN1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9992493&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding tubes&#160;</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>B1257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for grinding tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>B1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Salicylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>s3007-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>Made to order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>Made to order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td>146308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>952000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen High-Throughput Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu spin micro centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (10-100 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122 000.043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (30-300&#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122 000.060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (20&#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120 000.038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3552-HR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpie permanent marker</td>
			<td>Staples</td>
			<td>507130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-890</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the arabidopsis thaliana-pseudomonas syringae pathosystem

En l&#39;absence de cellules immunitaires mobiles spécialisées, les plantes utilisent leur mort cellulaire programmée localisée et systémique résistance acquise à se défendre contre les attaques de pathogènes. La contribution d&#39;un gène d&#39;Arabidopsis spécifique à la réponse immunitaire de l&#39;installation globale peut être spécifiquement et évalué quantitativement par dosage de la croissance de l&#39;agent pathogène dans le tissu infecté. Pendant plus de trois décennies, la bactérie hémibiotrophe Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) a été largement appliquée comme le modèle pathogène pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la réponse immunitaire Arabidopsis. Afin de fournir des agents pathogènes dans les tissus foliaires, de multiples méthodes de vaccination ont été mis en place, par exemple, une seringue infiltration, dip inoculation, pulvérisation, infiltration sous vide, et l&#39;inoculation d&#39;inondation. Le protocole suivant décrit une méthode d&#39;infiltration seringue optimisé pour fournir virulente Psm ES4326 dans les feuilles de l&#39;adultesol cultivé des plants d&#39;Arabidopsis et l&#39;écran avec précision pour une meilleure sensibilité à la maladie (EDS) en direction de cet agent pathogène. En outre, ce protocole peut être complétée avec de multiples pré-traitements pour disséquer défauts immunitaires spécifiques au sein des différentes couches de défense de la plante, y compris l&#39;acide salicylique (SA) Immunité -Triggered (IST) et immunitaires MAMP-Triggered (MTI).

Le protocole que nous décrivons ici représente un P. optimisé syringae essai seringue d&#39;infiltration d&#39;évaluer quantitativement la réponse immunitaire dans des plantes Arabidopsis. Comme illustré sur la figure 1, l&#39;infiltration de la seringue de la MSP ES4326 est suivie par l&#39;extraction et la quantification de l&#39;agent pathogène par des dilutions en série et colonies énumération. Comme décrit dans l&#39;étape...

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Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Bactérienne Feuille Infiltration Essai de caractérisation fine des réponses de défense des plantes à l&#39;aide du<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystème

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

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Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

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