Name: measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_135278) لطائرة أسرع من الصوت. MOP هو المستفيد من منحة الدكتوراه من صندوق البحوث AXA. نشكر باتريشيا Nigg للمساعدة في تصميم الشكل 1.

ملاحظة قبل البداية: غطاء محرك السيارة استخدام تدفق الصفحي والاحتواء المناسب عند العمل مع فيروسات حية. هنا، نحن تصف ظروف النمو المناسبة لسلالة فيروس الإنفلونزا الثقافة A / WSN / 33. قد تختلف وافر من العدوى (وزارة الداخلية) وحضانة مرات اعتمادا على سلالة الفيروس المستخدمة. </...

<ol>
	<li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+influenza+A+virus:+host+factors+and+antiviral+targets.">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virolog. 2, (2007).</li><li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line.">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li><li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li><li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry.">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway.">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans.">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li><li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN.">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li><li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans.">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li><li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry.">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li><li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication.">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li><li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu:+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy.">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li><li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes.">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li><li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death.">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Macey, M. G., Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Principles and Applications. , (2007).</li><li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes.">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li></ol>

يصف بروتوكول لدينا وسيلة سهلة لقياس مرفق الفيروس واستيعاب التدفق الخلوي. لأنها تتيح استخدام المسمى فيروس wildtype الذي يحاكي عن كثب العدوى بالفيروس مقارنة مع استخدام جزيئات الفيروسات مثل (فلب). في حين تم تحسين بروتوكول لدينا لقياس الحجز واستيعاب IAV يمكن بسهولة أن يتم تكي...

دخول فيروس الانفلونزا (IAV) هو عملية متعددة الخطوات التي تبدأ مع ربط الفيروس إلى المستقبلات على غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة 1. مستقبلات للIAV هو الحامض اللعابي التي هي موجودة على مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات السكرية والسكرية. وهيماغلوتينين (HA) البروتين من IAV التي هي موجودة في المغلف الفيروسي بربط الحامض اللعابي وبالتالي يتوسط مرفق من الجسيمات الفيروسية إلى غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة 2. ويدخل الفيروس الخلايا عن طريق بوساطة بالكلاذرين الإلتقام ولكن أيضا مسارات دخول بديلة، مثل macropinocytosis، وقد وصفت 3-6. التفاعل بين HA والحامض اللعابي يبدو أن يكون كافيا للوساطة على حد سواء، والتعلق واثار استيعاب جزيئات فيروسية 7. ومع ذلك، فقد تم اقتراح مستقبلات دخول بديلة ويجري حاليا التحقيق دورهم في دخول IAV 1،8،9. لئيماهلدف اليوم، وبذل الجهود لتحديد العوامل المضيفة التي تشارك في دورة حياة الفيروس بهدف تطوير العلاجات المضادة للفيروسات حاجة ماسة رواية 10-12. ان دخول الفيروس سيكون خطوة إيجابية لاستهداف النمو IAV من أجل منع العدوى الفيروسية في أقرب نقطة له. قياس مراحل مختلفة من دخول IAV هو تحدي تجريبيا كما هو مطلوب كميات كبيرة من الفيروس عادة للكشف عن الفيروسات واردة. وبالإضافة إلى ذلك، ومجموعة الكشف عن التغييرات في دخول الفيروس خطي الوحيد نظرا لعدم وجود تكاثر الفيروس. وهذا يؤكد الحاجة لفحوصات مع حساسية عالية. مقايسة نقدم هنا يسمح للكشف عن فيروس تعلق على سطح الخلية وكذلك الكشف عن فيروس المنضوية في ما يتعلق المبلغ الإجمالي للفيروس الخلايا المرتبطة. استخدام فيروس wildtype المعقدة البيروكسيديز يمكن قياس مريحة من خلال تلطيخ مع STV-CY3 وقراءات التدفق الخلوي. فيروس المعقدة البيروكسيديز هو الباردة المنضم إلى خليةالصورة للسماح للمرفق ولكن منع تدخيل الجسيمات الفيروسية. الخلايا يمكن أن تكون ثابتة، permeabilized وملطخة STV-CY3 لقياس الفيروسات المرفقة. إشارة من خارج الخلية، virions المرفقة يمكن إلغاؤها إذا تم تطبيق خطوة حجب قبل التثبيت التي يتم تحضين الخلايا مع streptavidin غير المسمى (STV). في الخطوة التالية، بعد الحجز على المعقدة البيروكسيديز IAV، هو تحول درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، ويتم السماح استيعاب الجسيمات الفيروسية لتأخذ مكان. محمية جزيئات المنضوية من ربط STV مما يسمح للتمييز بين الفيروسات من خارج وداخل الخلايا. في حالة تجريبية، يطلب من أربع عينات: &#39;0 دقيقة&#39;: العينة الأولى، وصفت &#39;0 دقيقة، هو قياس فيروس البرد محددة على سطح الخلية. &#39;0 دقيقة + STV&#39;: النموذج الثاني، المسمى &#39;0 دقيقة + STV &quot;، ويعطي خط الأساس كثافة إشارة من التجربة. تم منع الفيروسات المرفقة الطرافةيجب أن تكون ح STV والإشارة التالية تلطيخ مع STV-CY3 أقل بكثير مقارنة مع عينة &#39;0 دقيقة. &#39;30 دقيقة &#39;: العينة الثالثة، &#39;30 دقيقة&#39; يحتوي المرفق والمنضوية الفيروس بسبب التحول درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. &#39;30 دقيقة + STV &#39;: العينة الرابعة، &#39;30 دقيقة + STV &quot;التدابير جزء داخل الخلايا من الفيروسات. يتم تطبيق الخطوة حجب STV بعد فترة الحضانة 30 دقيقة. ونتيجة لذلك، والجسيمات الفيروسية على سطح الخلية ملزمة STV ترك الفيروسات المنضوية متاحة فقط لتلطيخ مع STV-CY3. ويمكن حساب القيمة النسبية للفيروس المنضوية كنسبة من فيروس المنضوية (تقاس في دقيقة &#39;30 + STV &quot;عينة) مقسوما على المبلغ الإجمالي للفيروس (التي وصفها &#39;30 دقيقة &#39;العينة). والضوابط نقترح أن تتضمن خلايا وهمية المصابة. إشارة التالية STV-CY3 تلطيخ الخلايا وهمية المصابة يعطي الخلفيةالناتجة عن بروتوكول تلطيخ. عنصر تحكم لمرفق IAV هي المعالجة المسبقة من الخلايا البكتيرية مع النورامينيداز (NA). NA يشق قبالة الحامض اللعابي من بروتينات سكرية الخلوية، وبالتالي إزالة مستقبلات المرفق من سطح الخلية. أزيد الصوديوم (SA) هو المانع الأيضية قوية وبالتالي كتل الإلتقام 13. الخلايا تعامل مع أزيد الصوديوم يجب أن تكون إيجابية لفيروس ملزم ولكن السلبي لاستيعاب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR Calbiochem</td>
			<td>126579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>20092391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Rad Protein Bio Assay</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td>
			<td>Milian</td>
			<td>82 00 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>&#160;Lucerna chem&#160; Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Hemotec HmbH</td>
			<td>253070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV-Cy3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial neuraminidase/sialidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6514-1UN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

ويرد الكرتون واصفا الشروط الأربعة تجريبية مختلفة في الشكل 1 يتم عرض نتائج تجربة تمثيلية في الشكلين 2 - 5. في &quot;0 دقيقة&quot; عينة والفيروسات المعقدة البيروكسيديز بارد محددة لاستهداف الخلايا التي يمكن تصور من قبل STV-CY3 تلطيخ (الشكلان 1 و 2).</str...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا A الفيروسات في خلايا A549 بواسطة التدفق الخلوي

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

دراسة التوتة اختيار الإيجابية والسلبية من قياس التدفق الخلوي

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

فيروس الإنفلونزا أ الفيروس دراسات في نموذج ماوس للإصابة

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

قياس الإنفلونزا تحييد ردود الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية قبل درياقي فحوصات باستخدام خلايا مدكك-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

قياس كثرة الفندره من الرشاشيات تبخير كونيديا من قبل الكريات البيضاء البشرية باستخدام تدفق الخلوي

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...