Name: generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood
Uploaded: 2015-12-23T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood at JoVE.com

This work was supported by grants funded by the British Heart Foundation (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, the Cambridge Biomedical Research Centre, National Institute of Health Research including (i) the BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) the BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke's Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust and (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust, and supported the Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO is funded by a BHF Intermediate Fellowship. FNK is funded by a BHF PhD Studentship.

<ol>
	<li>Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis,+angiogenesis,+and+growth+factors:+ephrins+enter+the+fray+at+the+border.">Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border.</a> Cell. 93, 661-664 (1998).</li><li>Flamme, I., Fr&#246;lich, T., Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+vasculogenesis+and+embryonic+angiogenesis.">Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis.</a> J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).</li><li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis.">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li><li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells.">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li><li>Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+the+therapeutic+actions+of+endothelial+progenitor+cells+in+pulmonary+hypertension.">Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).</li><li>Hur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two+types+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+different+contributions+to+neovasculogenesis.">Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li><li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Toshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+analysis+reveals+a+specific+HOX+signature+associated+with+positional+identity+of+human+endothelial+cells.">Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells.</a> PLOS ONE. 9, e91334 (2014).</li><li>Toshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+dysfunction+of+endothelial+progenitors+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension.</a> Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).</li><li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+storage+and+secretion+of+von+Willebrand+factor+in+blood+outgrowth+endothelial+cells+derived+from+patients+with+von+Willebrand+disease.">Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease.</a> Blood. 121, 2762-2772 (2013).</li><li>O'Neill, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+revascularisation+of+ischaemic+tissue:+the+opportunities+and+challenges+for+therapy+using+vascular+stem/progenitor+cells.">Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells.</a> Stem Cell Res &amp; Ther. 3, 31 (2012).</li><li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Practical+and+Efficient+Cellular+Substrate+for+the+Generation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adults:+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells.">A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells.</a> Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).</li><li>Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+endothelial+colony+forming+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood.">Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood.</a> Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).</li><li>Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+outgrowth+endothelial+cells+from+peripheral+blood.">Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood.</a> Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).</li><li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+large+scale+expansion+of+adult+human+endothelial+colony+forming+progenitor+cells.">Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells.</a> Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.
Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.
Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.13 This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

अभी हाल तक, नए रक्त वाहिकाओं के प्रसवोत्तर पीढ़ी पूर्व मौजूदा वाहिकाओं के endothelial कोशिकाओं से नए जहाजों की अंकुरण के रूप में परिभाषित angiogenesis के रूप में जाना एक प्रक्रिया है, के माध्यम से विशेष रूप से घटित करने के लिए माना जाता था। 1 यह प्रक्रिया vasculogenesis से विरोधाभासों, या भ्रूण के दौरान विशेष रूप से घटित करने के बारे में सोचा गया था, जो endothelial पूर्वज से रक्त वाहिकाओं के नए सिरे से गठन। 2 हालांकि, हाल ही के अध्ययन की पहचान की और वयस्कों के परिधीय रक्त में endothelial पूर्वज कोशिकाओं (निर्यात संवर्धन परिषदों) घूम अलग है। इन कोशिकाओं को संस्कृति में परिपक्व endothelial कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के अधिकारी और प्रसव के बाद vasculogenesis में भाग लेने के लिए माना जाता है। 3,4 अलगाव और इन निर्यात संवर्धन परिषदों के विस्तार के लिए प्रोटोकॉल आम तौर पर Vascul सहित endothelial वृद्धि कारकों युक्त मीडिया में परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMNCs) की संस्कृति को शामिलएआर endothelial वृद्धि कारक (VEGF) और fibroblast वृद्धि कारक-2। 5-8 ईपीसी संस्कृतियों नाटकीय रूप से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की एक किस्म का उत्पादन। प्रारंभिक संस्कृतियों (&lt;7 दिन) &quot;जल्दी&quot; निर्यात संवर्धन परिषदों के रूप में साहित्य में जाना जाता है एक monocytic सेल प्रकार, का प्रभुत्व है। उनके नाम के बावजूद, इन कोशिकाओं एककेंद्रकश्वेतकोशिका मार्कर CD14 व्यक्त करते हैं, पूर्वज मार्कर CD34 के लिए नकारात्मक हैं और शास्त्रीय एन्दोथेलिअल मार्कर CD31 और वीईजीएफ़ रिसेप्टर 2 (VEGFR2) के न्यूनतम स्तर को व्यक्त करते हैं। 5 लगातर संस्कृति कोशिकाओं के एक माध्यमिक आबादी को जन्म देता है, endothelial कोशिकाओं की तरह के रूप में विचारशील कालोनियों दिखाई देते हैं, जो देर परिणाम निर्यात संवर्धन परिषदों या रक्त परिणाम endothelial कोशिकाओं (BOECs) के रूप में जाना जाता है। Monocytic जल्दी निर्यात संवर्धन परिषदों के विपरीत, यह भी endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (ECFCs), परिणाम endothelial कोशिकाओं या देर परिणाम endothelial कोशिकाओं बुलाया गया है जो BOECs, endothelial सेल monolayers की खासियत है कि पत्थर आकृति विज्ञान प्रदर्शन और सतह मार्कर काफी हद तक समान5 और जीन अभिव्यक्ति 9 endothelial कोशिकाओं परिपक्व करने के लिए। परिधीय रक्त से endothelial कोशिकाओं की तरह की पीढ़ी के लिए विशेष रूप से इस तरह के फेफड़े के धमनी उच्च रक्तचाप (पीएएच) 10 या वॉन Willebrand रोग। 11 प्रायर BOECs की उपलब्धता के लिए, एन्दोथेलिअल के रूप में संवहनी विकारों के साथ जुड़े endothelial सेल में शिथिलता के अध्ययन के लिए, कई लाभ प्रदान करता है कोशिकाओं केवल जन्म के समय गर्भनाल नस से मृत्यु या अंग प्रत्यारोपण, या अलग-थलग करने के समय में explanted अंगों से प्राप्त किया जा सकता है। यह कम उपलब्धता हृदय रोगों, साथ ही endothelial कोशिकाओं और या तो रक्त कोशिकाओं या भित्ति कोशिकाओं के बीच बातचीत के साथ रोगियों से endothelial कोशिकाओं के जीव विज्ञान को समझने के लिए एक गंभीर सीमा का प्रतिनिधित्व किया। इसके अलावा, अलग-थलग करने और इन स्रोतों से endothelial कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी संवर्धन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और इन तरीकों से ली गई कोशिकाओं केवल एक limite का प्रदर्शनडी proliferative क्षमता। BOECs इसलिए रोगी व्युत्पन्न प्राथमिक endothelial कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक मूल्यवान किराए की पेशकश करते हैं। उनकी इन विट्रो अनुप्रयोगों के अलावा, BOECs भी ऑटोलॉगस कोशिका प्रत्यारोपण चिकित्सा में संभावित रूप से उपयोगी हैं। ये आवेदन पत्र 13 BOEC व्युत्पन्न IPSCs रोग मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता neovascularization (उसमें 12 और संदर्भ देखें) को बढ़ावा देने के लिए दोनों endothelial सेल प्रत्यारोपण, साथ ही प्रेरित स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी (IPSCs)। में शामिल हैं और शुरू करने के रूप अपार क्षमता की पेशकश ऑटोलॉगस सेल उपचार के लिए सामग्री। BOECs तेजी से और त्वचा fibroblasts की तुलना में उच्च दक्षता के साथ reprogram। इसके अलावा, BOECs भी अनुवादकीय अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हो जाएगा कि किसी भी तकनीक का एक अनिवार्य विशेषता है जो karyotypic असामान्यताओं, के लिए स्वतंत्र हैं कि IPSCs की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं। एक मरीज को खून का नमूना एक से IPSCs उत्पन्न करने की क्षमताLSO जिससे घाव भरने के विकारों, या बहुत युवा के साथ रोगियों से कोशिकाओं की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाने के लिए एक त्वचा बायोप्सी के लिए की जरूरत है और त्वचा fibroblasts की पीढ़ी, समाप्त। नीचे विस्तृत प्रोटोकॉल, ने मंजूरी दे दी है और राष्ट्रीय अनुसंधान आचार सेवा समिति (इंग्लैंड के पूर्व) के दिशा-निर्देशों के अनुसार आयोजित एक अपेक्षाकृत छोटी मात्रा से 90% से अधिक कुशलता के साथ BOECs की पीढ़ी के लिए एक आसान और विश्वसनीय विधि (60 प्रदान करता है एमएल) परिधीय रक्त की। इन कोशिकाओं को अत्यधिक proliferative हैं और एक भी रक्त के नमूने से कोशिकाओं के लाखों लोगों के सैकड़ों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, बार-बार passaged जा सकता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe with luer-lok tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19G Surflo Winged Infusion Set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SV-19BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1450</td>
			<td>2 per donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Martindale Pharmaceuticals</td>
			<td>270541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For buffy coat isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wrapped plastic transfer pipettes</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>KC231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turk&#8217;s Solution</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.093E+09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For cell culture, passaging and freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Collagen (derived from rat tail)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>35-4236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.02M Acetic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>prepared in reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2MV 
			(containing Bullet Kit, but not serum)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>Note: It is essential that the medium does not contain heparin.&#160;&#160; 
			Do not use EGM-2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>T4174</td>
			<td>Dilute to 1x in PBS prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For flow cytometric characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555397</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: WM59 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555445</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: WM59 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti-human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555824</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560976</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: HI30 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB357A</td>
			<td>Mouse IgG1, Clone: 89106 
			Dilution: 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td>Clone: MOPC-21 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone: MOPC-21 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC002A 
			Dilution: 1:10</td>
			<td>Clone: 11711</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For immunofluorescent microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 24-well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB72271</td>
			<td>Clone 756510, IgG1, use at 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF938</td>
			<td>Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154193</td>
			<td>Clone EPSISR15, use at 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>Polyclonal,&#160; 2 mg/ml, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use at 1 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

रक्त का 60 मिलीलीटर से बफी कोट मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव आम तौर पर 100-150x10 6 कुल श्वेत रक्त कोशिकाओं अर्जित करता है। एक भी टी -75 फ्लास्क में चढ़ाया, जब unlysed सेल निलंबन में कोशिकाओं की बड़ी संख्या में यह मुश्किल brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर व्यक्ति पक्षपाती कोशिकाओं को हल करने के लिए बनाता है। बार-बार मध्यम परिवर्तन गैर पक्षपाती कोशिकाओं की निकासी में परिणाम और &quot;जल्दी&quot; निर्यात संवर्धन परिषदों monocytic के पक्षपाती आबादी के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं। दिन 7 में टी -75 लगभग 7x10 6 इन लम्बी पक्षपाती कोशिकाओं के शामिल होंगे। 7 से 14 दिन से, BOECs की कालोनियों कुप्पी (2A चित्रा) के भीतर दिखाई देनी चाहिए। कालोनियों के रूप में पहली 3-5 सन्निकट कक्षों दिखाई देते हैं। परिणाम कॉलोनी नंबर रक्त का 60 मिलीलीटर प्रति 1 से 10 कालोनियों से भिन्न हो सकते हैं। आम तौर पर, युवा दाताओं (यानी, 20-25 साल) पहले भी संस्कृति में दिखाई देते हैं जो परिणाम कालोनियों की एक बड़ी संख्या का उत्पादन करते हैं।BOECs कई सौ कोशिकाओं से मिलकर परिपत्र कालोनियों के रूप में कोशिकाओं के इस केंद्रीय समूह से पैदा करना। इन कालोनियों के भीतर कोशिकाओं एक क्लासिक एन्दोथेलिअल cobblestone आकारिकी दिखा रहे हैं। वे कालोनी के अनुसार लगभग 1000 कोशिकाओं होते हैं जब यह पारित होने के प्रारंभिक कालोनियों के लिए बेहतर है। परिणाम कालोनियों आम तौर पर 7 दिन संस्कृति में अपने मूल स्वरूप के बाद इस आकार तक पहुँचने। मूल कालोनियों एक नया टी -75 फ्लास्क में passaged रहे हैं, वे 5 दिन या उससे कम समय (चित्रा 2 बी) के भीतर एक मिला हुआ monolayer (फ्लास्क प्रति 3-5x10 6 कोशिकाओं) के रूप में पैदा करना चाहिए। विलगन का एक छोटा सा प्रतिशत में (&lt;10%), परिणाम कालोनियों प्रकट करने के लिए असफल हो, या इस प्रारंभिक passaging के कदम के बाद पर्याप्त पैदा करना नहीं है। अपनी पहली passaging के बाद कम प्रसार कि प्रदर्शन BOECs शायद ही कभी स्थिर BOEC विलगन हो जाते हैं और अक्सर 2-3 मार्ग भीतर proliferating को रोकने के लिए चले जाते हैं। monocyticBOEC संस्कृतियों के भीतर निहित जल्दी निर्यात संवर्धन परिषदों गैर proliferative हैं और आम तौर पर 1-2 मार्ग भीतर संस्कृतियों से मंजूरी दे दी है। इन प्रारंभिक कोशिकाओं की क्लीयरेंस सेल मौत की वजह से है, जल्दी कोशिकाओं की विफलता passaging और दोहराया passaging के साथ गैर proliferative जल्दी निर्यात संवर्धन परिषदों के कमजोर पड़ने के बाद फिर से पालन करने के लिए। मार्ग 1 कोशिकाओं या तो संस्कृति में आगे passaged या बाद में उपयोग के लिए नीचे जमे हुए किया जा सकता है। एक स्थिर अलगाव उत्पन्न हो जाने के बाद, कोशिकाओं को मौन बनने से पहले पारित होने के 8 या 9 तक 3-5 नए टी 75 बोतल के लिए एक मिला हुआ कुप्पी की दर से passaged जा सकता है। फिर, सेल घनत्व संस्कृति भर में महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव में, कोई कम 750,000 से कोशिकाओं के विकास गिरफ्तारी पैदा कर सकता है कम सेल घनत्व के रूप में, एक टी -75 फ्लास्क में चढ़ाया जाना चाहिए। BOECs के उच्च proliferative क्षमता के बावजूद, कोशिकाओं को भी overconfluent बनने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए (यानी।,&gt; फ्लास्क प्रति 5x10 6 कोशिकाओं) इस convers पैदा कर सकता है के रूप में<html> एक गैर proliferative phenotype के लिए BOECs के आयन। हम एक BOEC एन्दोथेलिअल मार्करों के लिए उचित कोशिका की सतह और intracellular धुंधला प्रदर्शित करना चाहिए के रूप में किसी भी सेल चिह्नित किया जा रहा है कि प्रस्ताव। BOECs की विशेषता ठेठ endothelial सेल मार्करों के लिए धुंधला निम्नलिखित, फ्लो (चित्रा 3) या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। BOECs endothelial सतह मार्कर CD31 और VEGFR2 के लिए सकारात्मक रहे हैं और एककेंद्रकश्वेतकोशिका मार्कर CD14 और अखिल ल्युकोसैट मार्कर CD45 के लिए नकारात्मक हैं। BOECs भी WEIBEL-Palade शव उठा रहे हैं और इस प्रकार असतत, कबरा साइटोप्लास्मिक धुंधला के रूप में वॉन Willebrand फैक्टर (vWF) व्यक्त करते हैं। ऐसे फेफड़े के धमनी या महाधमनी endothelial कोशिकाओं के रूप में अन्य परिपक्व endothelial सेल प्रकार के विपरीत, BOECs भी उनकी सतह पर पूर्वज और सक्रियण मार्कर CD34 व्यक्त करते हैं। ftp_upload / 53,384 / 53384fig1.jpg &quot;/&gt; एन्दोथेलिअल मध्यम विकास में कोलेजन लेपित प्लेटों पर चित्रा 1. BOEC पीढ़ी प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख। परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear घनत्व ढाल centrifugation द्वारा शिरापरक रक्त से अलग कर रहे हैं और सुसंस्कृत एफबीएस परिभाषित हैं। BOEC कालोनियों संस्कृति के 7-14 दिनों के भीतर दिखाई देते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig2.jpg" /> चित्रा प्रतिनिधि BOEC संस्कृतियों का 2. brightfield छवियों। (ए) परिणाम कालोनियों एक पत्थर monolayer में व्यवस्था की है और एक केंद्रीय बिंदु से त्रिज्यात बाहर पैदा करना जो कर रहे हैं endothelial कोशिकाओं की तरह, के संग्रह के रूप में उपस्थित दिन 7 और 14 कालोनियों के बीच संस्कृतियों में दिखाई देते हैं। आसपास के परिणाम कालोनियों पक्षपाती मोनो हैंजल्दी संस्कृतियों में कोशिकाओं के विशाल बहुमत को बनाने वाली cytic कोशिकाओं। पहले के रूप में वर्णित इन कोशिकाओं, &quot;जल्दी&quot; endothelial पूर्वज कोशिकाओं, एक धुरी की तरह आकारिकी है और monocytic मार्कर CD14 व्यक्त करते हैं। गैर proliferative monocytic कोशिकाओं से मरने या passaging के बाद फिर से संलग्न करने के लिए असफल रूप में या तो (बी) passaging के बाद, अत्यधिक proliferative BOECs, संस्कृतियों भर में ले। स्केल बार 250μm। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig2large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र तीन" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig3.jpg" /> चित्रा फ्लो द्वारा BOECs 3. विशेषता। BOECs trypsinized और विशिष्ट सतह मार्कर (लाल रेखा) के खिलाफ निर्देशित fluorescently संयुग्मित निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी (भरा शिखर ग्रे) या एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। Cytometric लक्षण वर्णन के लिए सतह मार्करhematopoietic मार्कर CD45 और CD14, endothelial मार्कर CD31 और VEGFR2 और progentior और endothelial सक्रियण मार्कर CD34 शामिल हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig3large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig4.jpg" /> Endothelial सेल मार्करों के लिए BOECs चित्रा 4 Immunofluorescent धुंधला। BOECs के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों endothelial सेल सतह मार्कर CD144 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ (-cadherin किया है, शीर्ष सही पैनल) और रक्त ग्लाइकोप्रोटीन वॉन Willebrand फैक्टर (vWF, नीचे सही पैनल) immunostained । परमाणु DAPI धुंधला दिखा इसी पैनल के बाईं ओर दिखाए जाते हैं। स्केल बार 50μm। CD144 के लिए। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig4large.jpg" target="_blank">एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें</a>इस आंकड़े के संस्करण।

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Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

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