Name: chromatin immunoprecipitation assay for the identification of arabidopsis protein-dna interactions in vivo
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo at JoVE.com

The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Econom&#236;a y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).

1. يشابك من المواد النباتية (1 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينمو نبات الأرابيدوبسيس خطوط المستخدمة في التجربة (النوع البري - WT - مقابل المسوخ، و / أو خطوط معربا عن النسخة الموسومة البروتين الخاص بك من الفائدة مقابل خطوط معربا عن العلامة لا تنصه?...

<ol>
	<li>Andres, F., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+flowering+responses+to+seasonal+cues.">The genetic basis of flowering responses to seasonal cues.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).</li><li>Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+flowering+by+ambient+temperature.">Control of flowering by ambient temperature.</a> J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).</li><li>Jarillo, J. A., Pi&#241;eiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+is+everything+in+plant+development.+The+central+role+of+floral+repressors.">Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors.</a> Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).</li><li>Pajoro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+(r)evolution+of+gene+regulatory+networks+controlling+Arabidopsis+plant+reproduction:+a+two-decade+history.">The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history.</a> J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).</li><li>He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+regulation+of+flowering.">Chromatin regulation of flowering.</a> Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).</li><li>Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodeling+in+plant+development.">Chromatin remodeling in plant development.</a> International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).</li><li>Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+protocol+for+studying+histone+modifications+in+Arabidopsis+plants.">An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).</li><li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3, 11 (2007).</li><li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+of+plant+transcription+factors+followed+by+sequencing+(ChIP-SEQ)+or+hybridization+to+whole+genome+arrays+(ChIP-CHIP).">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP).</a> Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).</li><li>Gomez-Mena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=early+bolting+in+short+days:+An+Arabidopsis+mutation+that+causes+early+flowering+and+partially+suppresses+the+floral+phenotype+of+leafy.">early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy.</a> Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).</li><li>Pi&#241;eiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EARLY+BOLTING+IN+SHORT+DAYS+is+related+to+chromatin+remodeling+factors+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis+by+repressing+FT.">EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT.</a> Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).</li><li>Lopez-Gonzalez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-dependent+repression+of+the+Arabidopsis+floral+integrator+genes+involves+plant+specific+PHD-containing+proteins.">Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins.</a> Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. , e3998 (2012).</li><li>Wong, M. L., Medrano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+for+mRNA+quantitation.">Real-time PCR for mRNA quantitation.</a> Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).</li><li>Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+formaldehyde+fixation+and+immunoprecipitation+technique+for+studying+protein-DNA+interactions.">A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions.</a> Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).</li><li>Yu, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISTONE+DEACETYLASE6+interacts+with+FLOWERING+LOCUS+D+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis.">HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+histone+H3+lysine+9+acetylation+and+dimethylation+in+Arabidopsis+reveals+correlation+between+multiple+histone+marks+and+gene+expression.">Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression.</a> Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).</li><li>Lafos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+H3K27+trimethylation+during+Arabidopsis+differentiation.">Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation.</a> PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).</li><li>Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+cells+and+isolation+of+high-quality+RNA+after+cryosectioning.">Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning.</a> Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li><li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+genes+of+the+MADS+transcription+factor+SEPALLATA3:+integration+of+developmental+and+hormonal+pathways+in+the+Arabidopsis+flower.">Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower.</a> PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).</li></ol>

بروتوكول الشذرة الموصوفة هنا هو أسلوب استنساخه وقوية لتحليل التفاعلات بين البروتينات وتسلسل الحمض النووي محددة في الجسم الحي في النباتات نبات الأرابيدوبسيس. A تحديد الناجح لمواقع الربط للبروتينات ذات الاهتمام يتطلب اختيار كافية من أجهزة النبات أو مراحل النمو ...

خلال السنوات الأخيرة تم تطوير مجموعة واسعة من الأدوات الجينية، الجزيئية والجينوم في أنواع نموذج نبات الأرابيدوبسيس thaliana. هذه التكنولوجيا قد سهلت بشكل كبير من التقدم في فهم كيفية تنظيم تطوير المصنع. ومن بين العمليات التنموية المدروسة باستخدام نبات الأرابيدوبسيس كنموذج، والسيطرة الوراثية من الوقت المزهرة تم تحليلها على نطاق واسع. وقد أظهرت هذه الدراسات أن النباتات تعدل بدقة متناهية وقت المزهرة في استجابة لمنبهات الذاتية مثل الهرمونات وعمر النبات، وأيضا لإشارات البيئية مثل الإضاءة ودرجة الحرارة التي تزامن المزهرة الوقت مع الدورة الطبيعية للمواسم 1، 2. وقد تم عزل وتوصيف المسوخ نبات الأرابيدوبسيس مع بعض التعديلات في وقت الإزهار حاسما في كشف شبكة معقدة من الجينات التي تنظم للمرة المزهرة استجابة لعوامل داخلية والبيئية. هذه الدوائر الجينيةمتكاملة على مستوى عدد قليل من الجينات الرئيسية التي تكون بمثابة مفاتيح المزهرة، والتوقيت الدقيق لبدء الأزهار يعتمد على ميزان المزهرة تعزيز وقمع الأنشطة التي تعمل المنبع من الجينات تكامل الأزهار 1،3. وقد كشفت توصيف وظيفي من الجينات التي تم تحديدها لدورها في مراقبة المزهرة بدء، وبمساعدة من استخدام الأخير من النهج الجينومية، والدور المركزي للتنظيم النسخي في التشكيل من الوقت المزهرة. في الواقع، العديد من الجينات سيد المزهرة ترميز عوامل النسخ 4. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدد من لونين مجمعات البروتين إعادة تؤثر على التعبير عن الجينات سيد المزهرة. تحول عدد من المسوخ نبات الأرابيدوبسيس معزولة لمن تغير الوقت المزهرة إلى تحمل طفرات في جينات ترميز مجموعة متنوعة من معدلات الكروماتين. و remodelers لونين مختلفة إدخال تعديلات posttranslational في هيستونالبريد ذيول، أعد nucleosomes نسبة إلى DNA أو تبادل الهستونات الكنسي من قبل المتغيرات هيستون ضرورية لتنظيم السليم لالمزهرة في نبات الأرابيدوبسيس 5،6. بعض هذه الأنشطة إعادة عرض لونين تحفيز ترسب أو إزالة التعديلات التساهمية مثل أستلة أو مثيلة في بقايا هيستون محددة. يتم التعرف على هذه العلامات هيستون تحديدا مؤثرات المتخصصة التي تجند أخرى مجمعات ونين إعادة عرض، عوامل النسخ أو مكونات الآلات النسخي لتنظيم النشاط النسخي الجينات المزهرة. لونين مناعي (رقاقة) يسمح بتحديد المواقع في الجسم الحي للبروتينات ذات الاهتمام ملزم الحمض النووي (الشكل 1). يأخذ هذا الإجراء الاستفادة من قدرة بعض المواد الكيميائية إلى عبر الارتباط البروتينات على الحمض النووي. مما أدى المجمعات الحمض النووي والبروتينات ويمكن بعد ذلك immunoprecipitated باستخدام الأجسام المضادة الآغا محددةالعوامل انست النسخ والبروتينات ملزم لونين، أو تعديلات معينة والحواتم مغاير (يشار اليه عادة باسم &quot;العلامات&quot;) التي تعلق على البروتين في الاختيار. الحمض النووي تنقيته من هذه immunoprecipitates يمكن استخدامها كقالب في PCR (QPCR) ردود فعل الكمية لتقييم لإثراء تسلسل معينة من الاهتمام. وبهذه الطريقة، يمكن إنشاء مواقع الربط من عوامل النسخ أو توزيع علامات هيستون في جينات معينة 7،8. وبالإضافة إلى ذلك، جنبا إلى جنب مع الجيل التالي من التسلسل (خ ع) التي تمكن التسلسل الموازي ضخمة، جعلت تكنولوجيا رقاقة الممكن تحديد الجينوم على نطاق مواقع الربط من عوامل النسخ فضلا عن المناظر الطبيعية epigenomic الكشف عن التعديلات هيستون. وعلاوة على ذلك، فإن التحليل في وقت واحد في التعبير الجيني يسمح مراقبة كيفية الربط المنظمين النسخي أو ترسب معينة علامات هيستون ترتبط مع النسخي activiتاي من الجينات 9. وقد سمح باستخدام بروتوكولات الشذرة في نبات الأرابيدوبسيس تقييم الأثر أن مجموعة متنوعة من المنظمين النسخي لها بشأن تنظيم لونين الجينات سيد المزهرة وكيف يمكن لهذه التغيرات الهيكلية تؤثر التعبير الجيني 5،6. وأظهرت النتائج السابقة أن انشقاقه المبكر نبات الأرابيدوبسيس مكان في أيام قصيرة (EBS) بمثابة كاظمة المزهرة والمسوخ في هذا المعرض الجينات تسارع المزهرة وupregulation من الجين سيد المزهرة FT. بالإضافة إلى ذلك، الخسارة من وظيفة الطفرات في FT قمع تماما النمط الظاهري المزهرة في وقت مبكر من النباتات EBS متحولة، مشيرا إلى أن FT مطلوب من أجل ازدهار سابق لأوانه من المسوخ EBS وأن EBS هو ضروري لقمع هذا الجين سيد المزهرة 10 11. بترميز EBS البروتين التي تحتوي على الدكتوراه التي يمكن أن تربط خصيصا هيستون H3 البروميد وtrimethylated في الالبريد يسين 4 بقايا (H3K4me2 / 3)، مما يشير إلى دور لEBS في قمع بوساطة لونين من FT 12. أظهر استخدام نهج الشذرة أن نبات الأرابيدوبسيس التي تحتوي على البروتين الدكتوراه EBS 10،11 يربط المناطق التنظيمية من الأزهار FT تكامل الجيني لقمع التعبير عنها 12. وأظهرت بيانات إضافية تم الحصول عليها من خلال استخدام تكنولوجيا رقاقة ما هو مطلوب هذا البروتين للحفاظ على مستويات منخفضة من أستلة هيستون، وهي السمة المميزة النسخ نشط، في لونين من هذا الجين سيد المزهرة خلال المراحل الأولى من تطوير نبات الأرابيدوبسيس. هذه الملاحظات، جنبا إلى جنب مع بيانات التعبير الجيني والجينات، وتثبت أن هذا نبات الأرابيدوبسيس الدكتوراه التي تحتوي على البروتين له دور مركزي في ضبط الوقت المزهرة عن طريق تحوير التعبير عن تكامل جين الأزهار FT 12. العمل المقدم هنا يوفر وسيلة الأمثل مفيد ليس فقط لتحليل الهستونات ولكن أيضا لأغراض أخرىلونين المرتبطة البروتينات، ومع زيادة الكفاءة وتقليل الوقت التجريبية. وعلاوة على ذلك، يوضح هذا التقرير كيف قدمت استخدام بروتوكولات الشذرة رؤى جديدة في العلاقة بين التغيرات في تعديلات لونين والدول النسخي من جينات النباتات، وكيف يمكن لهذه الآليات بوساطة لونين من تأثير السيطرة التعبير الجيني في بداية المزهرة في نبات الأرابيدوبسيس.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25</td>
			<td>Use under the fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Standard sonication device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01010002 (UCD200TO)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#174; magnetic beads coupled with protein A or protein G</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10003D/10001D</td>
			<td>Check manufacturer&#8217;s manual for antibody affinity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 Surfact-Amps&#8482; Detergent Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>85112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mouse, rat, rabbit&#8230;)-IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15400001, C15420001, C15410206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack - DynaMag&#8482;-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex&#174; 100 Resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#174; 480 SYBR Green I Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation assay for the identification of arabidopsis protein-dna interactions in vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

يمكن خص ثمانية خطوات رئيسية في هذا البروتوكول رقاقة لتحديد المجراة التفاعلات DNA البروتين، بما في ذلك زراعة وحصاد المواد النباتية، عبر ربط لونين، والعزلة لونين، تجزئة لونين، والعزلة انتقائية من المجمعات بين الحمض النووي و البروتين من الاهتمام من قبل مناعي، هضم ...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

مناعي لونين هي تقنية قوية لتحديد المواقع DNA من البروتينات في الجسم الحي نبات الأرابيدوبسيس ملزمة. ويشمل هذا الإجراء لونين عبر ربط والتشرذم، مناعي مع الأجسام المضادة انتقائية ضد البروتين من الفائدة، وتحليل QPCR من الحمض النووي ملزمة. نحن تصف مقايسة الشذرة بسيط الأمثل لمحطات نبات الأرابيدوبسيس.

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

The overall goal of this procedure is to unveil interactions between proteins and DNA in the chromatin of arabidopsis cells. This method can help answer key questions in the plant biology field, such as which genes are regulated by a given transcription factor, or what system modifications are associated with a transcriptional status of genes. The main advantage of this technique is that through the cross-linking step, it is possible to fix and capture changes in chromatin organization occurring during plant development.Though this method can provide a insight into protein interaction in arabidopsis thaliana, it also can be applied to different plant orders and adapted to other plant species. Demonstrating this procedure will be Dorota Komar and Alfonso Mouriz, two PhD students in our laboratory. After growing arabidopsis according to the text protocol, collect 1.5 grams of plant material in 50 milliliter tubes, and keep them on ice during cross-linking.Then, use a laboratory burner-heated needle to make little holes in the lids of the tubes. Add 40 milliliters of 1x pbs and 1.08 milliliters of formaldehyde to the tubes. Screw the lids on the tubes, and place the tubes in a desiccator.Vacuum infiltrate for 10 minutes, then carefully release the vacuum to prevent churning up the solution. After mixing the sample, repeat the vacuum and mixing steps. Upon infiltration, observe the plant material and confirm that it becomes slightly translucent and sinks to the bottom of the tube.Add 2.5 milliliters of two molar glycine to a final concentration of 0.125 molar and apply the vacuum for five minutes. After releasing the vacuum, discard the solution by inverting the tubes and allowing it to drip through the holes in the lids. Use pbs to rinse the plantlets twice, and rinse with water once.Then dry the plantlets on a paper towel before using liquid nitrogen to freeze. Per each immunoprecipitation, prepare 15 microliters of magnetic beads in a 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Add one milliliter of chromatin immunoprecipitation, or chip dilution buffer, to the beads, mix by rotation, and place the 1.5 milliliter microcentrifuge tube in a magnetic rack.After allowing the beads to attach to the magnet for about a minute, use a pipetman to remove the supernatant before repeating the wash. Re-suspend the beads in 200 microliters of chip dilution buffer. For immunoprecipitation add the required amount of the specific antibody to one of the two tubes prepared for each plant blind.A key factor in successful chip experiment is the chosen antibody for the immunoprecipitation of the protein of interest. Antibodies raised against plant transcription factor can be useful for chip experiments, but the serum has to be thoroughly tested. For example, antibodies checked only in Western blot analysis are not necessarily valid for chip.As a negative control, add the same amount of non-specific IGG to the second tube. Incubate the tubes at four degrees Celsius overnight on a rotating wheel to allow the antibody to attach to the beads. Using a mortar and pestle, thoroughly grind the frozen plant material in liquid nitrogen until the powder becomes homogeneous and light green.Transfer the powder to a new 50 milliliter tube. Under a fume hood, add 30 milliliters of extraction buffer one, and mix well to soak the tissue powder. From this step on, keep the samples at four degrees Celsius at all times, and make sure that the tissue is completely thawed before moving forward.Clear the slurry by passing it through a filtration tissue with a pore size of 22 to 25 micrometers into a new 50 milliliter tube. Then centrifuge at 1, 000 times g and four degrees Celsius for 20 minutes. Gently decant the supernatant from the pellet, which should be about two milliliters in volume.With five milliliters of extraction buffer two, re-suspend the pellet. Then centrifuge at 1, 000 times g and four degrees Celsius for 10 minutes. After decanting the supernatant, re-suspend the pellet in 300 microliters of extraction buffer three.In a separate tube, add 600 microliters of extraction buffer three and then carefully layer the re-suspended pellet on top of the clean buffer. Centrifuge the tube for one hour at 16, 000 times g at four degrees Celsius, followed by aspiration of the supernatant with a pipette. Next, use 300 microliters of sonication buffer to slowly re-suspend the nuclear pellet, avoiding bubble formation, which may affect sonication efficiency.Carefully transfer the suspension to a clean, 1.5 milliliter tube. Sonicate the suspension to lyse the nuclei and randomly share the chromatin into 200 to 600 base pair fragments. Verify the DNA fragment sizes on an agarose gel, then spin the solution at 12, 000 times g and four degrees Celsius for 10 minutes.Transfer the supernatant to a fresh 1.5 milliliter tube, and discard the pellet. Aliquot one-tenth of the supernatant into a new tube, and label it as input'before freezing at minus 20 degrees Celsius. Finally, make a ten-fold dilution of the chromatin in chip dilution buffer to achieve a final SDS concentration of 0.1 percent.Samples can then be frozen and stored at minus 20 degrees Celsius for several weeks. After incubating the beads with antibodies overnight, use one milliliter of chip dilution buffer to wash the beads three times, then re-suspend the beads in one milliliter of the diluted chromatin, and incubate the tube overnight on a rotating wheel at four degrees Celsius. The following day, place the beads on the magnetic rack at four degrees Celsius, and after removing the solution, use one milliliter of low-salt washing buffer to wash the beads twice, then use high-salt washing buffer to wash the beads once.After using one milliliter of lithium chloride washing buffer to wash the beads once, use one milliliter of TE buffer to wash the beads twice. Aspirate to thoroughly remove the TE wash buffer. Once the input samples are thawed, transfer five microliters of each into new 1.5 milliliter tubes, and moving forward, treat similarly to the chip samples.Reverse the cross-linking by adding 200 microliters of five percent chelating ion exchange resin and incubate at 95 degrees Celsius for 10 minutes, shaking every two to three minutes. Spin down at 16, 000 times g for 30 seconds, and carefully transfer the supernatant into new microfuge tubes. Add two microliters of 10 milligrams per milliliter protonase K, and incubate at 37 degrees Celsius for 30 minutes to digest proteins and release DNA.To stop the reaction, incubate at 95 degrees Celsius for 10 minutes, Quickly spin at 16, 000 times g for 30 seconds, and transfer the supernatant to a new tube. After cleaning the DNA according to the text protocol, dilute one to ten with water, and use five microliters per reaction to measure the abundance of binding sites by qPCR. Analyze the data according to the text protocol.Aribidopsis leaves are covered in wax layers and trichomes favor the formation of air bubbles, both of which make it difficult for cross-linking reagents to penetrate the plant tissue. Shown here are cross-linked seedling samples that were vacuum cross-linked to increase fixation efficiency. This figure demonstrates that an increased number of sonication cycles progressively reduces the average size of the DNA in chip samples, reaching the optimum enrichment in the range of 200 to 600 base pairs after 20 to 30 cycles, as demonstrated here.As seen in this figure, four regions important for the transcriptional regulation of the FT locus, a master gene of flowering, have been chosen for the analysis. Chip results demonstrate that the EBS protein combined one of the four regions tested, a regulatory sequence close to the transcriptional start site of FT.Finally, chip assays performed using an antibody directed against histone h3 acetylated in lysines nine and 14, which is correlated with transcriptionally active chromatin, revealed higher abundance of H3K9/14ac in mutant DBS versus wild type plants in all four genomic fragments of FT tested, consistent with the observed up-regulation of this master gene of flowering in this mutant. Once mastered, this technique can be done in two days if it is performed properly.Following this procedure, together with other measures like gene expression analysis, can contribute to answering other questions, like:What is the biological role of the binding of the protein to DNA? Is it at transcriptional activation or repression? And Which histone modifications are associated?After it's development, this technique paved the way for researchers in the field of plant epigenetics to explore chromatin states in our reductive cells. And this can be extended to other plant species. After watching this video, you should have a good understanding of how to analyse the binding of your aribidopsis protein of interest to DNA in vivo.Don't forget that working with 2-methoxyethanol, formaldehyde or sonicator reagents, pathogens and stem mutations can be extremely hazardous, and precautions such as protective clothes, gloves or hearing protection should be always taken while using this procedure.

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

مناعي لونين (CHIP) لتعديل هيستون الفحص الحيوي في التعبير الجيني في الخلايا البشرية المنشط

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

لونين مناعي (رقاقة) باستخدام ذبابة الفاكهة الأنسجة

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس<sup&gt; 15</sup&gt; N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

مناعي لونين كفاءة استخدام كميات محدودة من الكتلة الحيوية

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...