Name: purification and refolding to amyloid fibrils of (his)6-tagged recombinant shadoo protein expressed as inclusion bodies in e. coli
Uploaded: 2015-12-19T14:00:00
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The authors would like to acknowledge Natalie Doude and David Westerway (University of Alberta) for providing us Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) for plasmid construction, Michel Br&#233;mont (INRA) for providing us BL21Sol bacteria; Christine Longin (INRA) for TEM assistance and Edith Pajot-Augy (INRA) for comments and proofreading.

1. Generazione di plasmidi e Shadoo Expression Nota: Il gene che codifica la proteina murino Shadoo (Shadoo 25-122), è stato subclonato nel vettore di espressione pET-28 11. Questo clone è stata trasformata in E. coli SoluBL21 ceppo batterico, per esprimere la proteina Shadoo con un tag hexahistidine N-terminale, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG), come spiegato in preceden...

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CNS+glycoprotein+Shadoo+has+PrP(C)-like+protective+properties+and+displays+reduced+levels+in+prion+infections.">The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections.</a> The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).</li><li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-resistant+prions+selectively+decrease+Shadoo+protein.">Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002382 (2011).</li><li>Westaway, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+Shadoo+in+prion+infections+traces+a+pre-clinical+event+inversely+related+to+PrP(Sc)+accumulation.">Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002391 (2011).</li><li>Chevalier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PB1-F2+influenza+A+virus+protein+adopts+a+beta-sheet+conformation+and+forms+amyloid+fibers+in+membrane+environments.">PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).</li><li>Tarus, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+paths+of+the+nucleoprotein+of+influenza+A+virus.">Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus.</a> Biochimie. 94, 776-785 (2012).</li><li>Biancalana, M., Koide, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+Thioflavin-T+binding+to+amyloid+fibrils.">Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).</li><li>Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+system+as+a+screening+tool+for+pharmacological+assessment+of+g+protein+coupled+receptors.">Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors.</a> Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).</li><li>Schein, C. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+biosynthesis+of+glycosyl+phosphatidylinositol+protein+anchors.">The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors.</a> Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).</li><li>Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GPI-anchoring+of+PrP:+implications+in+sorting+and+pathogenesis.">The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis.</a> Prion. 8, 11-18 (2014).</li></ol>

Un protocollo semplice ed efficace sia per l&#39;espressione e la purificazione di una grande quantità di topo ricombinante proteina Shadoo è presentato. Il metodo descritto consente solubilizzazione successo e purificazione (His 6) -tagged proteina Shadoo ricombinante. È importante, come indicato nel titolo, che quando espresso in un batterio E. procariotico coli Shadoo accumula nei corpi di inclusione. Prima Shadoo purificazione, i batteri devono essere lisate per sonicazione in un tamp...

Prion malattie neurodegenerative, tra cui l&#39;encefalopatia spongiforme bovina nel bestiame, la scrapie ovina, malattia di Creutzfeldt-Jakob negli esseri umani, sono fatali e incurabile. Le malattie da prioni sono caratterizzate da cambiamenti conformazionali di proteina prionica cellulare principalmente composti da alfa-eliche, in cross-β-sheet arricchito amiloide conformer 1,2. Cross-beta-strutture contengono densamente imballati e beta-sheets cristallini come altamente ordinati stabilizzati con legami idrogeno 3,4. Amiloidi da prioni grado di autoreplicarsi causa delle beta-filoni sul bordo crescente che forniscono un modello per il reclutamento e la conversione di un&#39;unità proteina monomerica. Secondo l&#39;ipotesi &quot;unica proteina&quot;, conformero amiloide della proteina prionica è l&#39;unico agente infettivo. Tuttavia, alcune altre biomolecole sono state proposte per essere essenziali per disturbi prioni. Ad esempio, le membrane cellulari si pensa di essere un luogo in cui conversiin si svolge e alcuni lipidi caricati negativamente hanno dimostrato di migliorare il processo di conversione 5,6. Inoltre, alcune proteine ​​possono anche essere coinvolti in patologie da prioni. In particolare, ci sono altri due membri della famiglia proteina prionica: Doppel e Shadoo 7,8. Doppel ha una struttura relativamente rigida stabilizzata con ponti di-solfuro e non riesce ad auto-polimerizzarli e aggregata per fibrille amiloidi 9. In contrasto, simile alla proteina prionica, Shadoo può adottare una struttura β-sheet arricchito e di auto-associate in strutture fibrille amiloidi. È stato dimostrato che Shadoo può fibrillazione in condizioni native o dal legame membrane con carica negativa 10,11. Conversione di Shadoo in fibre amiloidi simili può essere associato a patologie. Infatti, i meccanismi con cui le strutture amiloidi simili causano la malattia sono poco conosciuti. Shadoo porta un dominio idrofobico (HD) e una serie di tandem Arg / Gly ripete simile to la parte N-terminale della proteina prionica (Figura 1A). Poiché la parte N-terminale della proteina prionica, Shadoo è altamente caricato positivamente e sembra essere una proteina nativa strutturati 11,12. Shadoo sembra essere funzionalmente correlati a disturbi da prioni dal momento che può legarsi direttamente proteina prionica. Inoltre, la sua espressione è regolata giù durante prioni patologia 13,14. Tuttavia, il ruolo di Shadoo in malattie da prioni non è ancora stabilita. Abbiamo sviluppato un plasmide che porta la sequenza codificante del gene murino Shadoo. Il plasmide è stato usato per trasformare E. coli per la produzione di N-terminale suo 6 proteina di fusione Shadoo. Questo sistema di espressione è ben consolidata nel nostro laboratorio ed è comunemente usato nei nostri progetti in corso 6,15,16. Una questione importante per l&#39;espressione del Shadoo è la scelta del E. coli. Mentre BL21 competente ceppo batterico è comunemente utilizzato per l&#39;espressione di pro ricombinanteproteine ​​Shadoo è stato espresso con successo e purificato solo dal ceppo batterico trasformato SoluBL21. SoluBL21 competente E. coli è una migliore mutante di ceppo ospite BL21 sviluppato per la produzione di proteine ​​la cui espressione nel BL21 genitore non dava prodotto solubile rilevabile. Espressione ad alto livello di Shadoo in SoluBL21 E. coli porta all&#39;accumulo della proteina in corpi di inclusione. Come caratteristica generale, quando una proteina non nativo è altamente espresso in E. coli, questa proteina si accumula nei corpi di inclusione insolubili. Shadoo probabilmente aggrega attraverso interazioni non covalenti idrofobiche o ionici (o una combinazione di entrambi) strutture dinamiche altamente arricchito formata dalla proteina ripiegata a vari gradi. Di conseguenza, la purificazione comprende almeno due fasi: (i) una separazione selettiva della proteina da altre biomolecole in un mezzo denaturazione, e (ii) un rinaturazione della proteina purificata mediante piegatura in vitrotecniche. La separazione selettiva di Shadoo è stato ottenuto in una soluzione tampone contenente urea 8M (o in alternativa 6M guanidina-HCl). La rimozione di urea e rinaturazione della proteina può essere fatto mediante diversi protocolli: (i) rinaturazione in una soluzione a pH acido per ottenere una proteina non strutturata Shadoo monomerica, o (ii) rinaturazione in una soluzione di pH ≥ 7 per ottenere Shadoo polimerizzato in fibre amiloidi stabili con caratteristici motivi cross-β-sheet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC&#160;</td>
			<td>GE, Amersham</td>
			<td># 1363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/60 Superdex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1069-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap IMAC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0920-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep26/10 Desalting column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoluBL21 Competent E. coli</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>C700200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-28b+</td>
			<td>Novogen</td>
			<td>69865-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Biophotometar</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trito X-100</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>85111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>656895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES3098T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gdn-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein size marker&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and refolding to amyloid fibrils of (his)6-tagged recombinant shadoo protein expressed as inclusion bodies in e. coli

Il sistema di espressione coli Escherichia è uno strumento potente per la produzione di proteine ​​eucariotiche ricombinanti. Lo usiamo per produrre Shadoo, una proteina appartenente alla famiglia prione. Un metodo cromatografico per la purificazione di (suo) 6 -tagged Shadoo ricombinante espressa come corpi di inclusione è descritto. I corpi di inclusione vengono solubilizzati in 8 M urea e legati ad un 2+ colonna -charged Ni eseguire cromatografia di affinità ionico. Proteine ​​legate sono eluite da un gradiente di imidazolo. Le frazioni contenenti proteine ​​Shadoo mediante cromatografia di esclusione dimensionale per ottenere una proteina altamente purificata. Nella fase finale è purificato Shadoo dissalati per eliminare i sali, urea e imidazolo. Proteina ricombinante Shadoo è un reagente importante per gli studi biofisici e biochimici di disturbi conformazione della proteina che si verificano nelle malattie da prioni. Molti rapporti hanno dimostrato che le malattie neurodegenerative da prioni provengono dalla deposizione di pugnalatale, ordinò fibrille amiloidi. Protocolli di esempio descrivono come alla fibrillazione Shadoo in fibrille amiloidi in acido e neutro / pHs di base sono presentati. I metodi su come produrre e fibrillazione Shadoo può facilitare la ricerca in laboratori che lavorano su malattie da prioni, in quanto consente per la produzione di grandi quantità di proteine ​​in maniera rapida e basso costo.

Circa 5-10 mg di proteine ​​Shadoo purificato viene ottenuto per litro di coltura batterica. Una purificazione a due fasi è necessario per ottenere Shadoo ricombinante di elevata purezza. Il primo passo è effettuata mediante cromatografia di affinità con un Ni 2 + colonna -charged che conserva i suoi-proteine ​​taggati. Frazioni eluite sono sottoposti a SDS-PAGE e colorazione con Coomassie Brilliant Blue (Figura 5A). Le frazioni contenenti proteine ​​Shadoo sono raggruppati e u...

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Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

Purificazione e ripiegando a amiloide fibrille di (sua)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged proteina ricombinante Shadoo Espresso come corpi di inclusione in<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Research

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Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

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