Name: generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues
Uploaded: 2016-01-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues at JoVE.com

This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

עכברים שוכנו בתנאי הפתוגן ללא בעמידה בהנחיות המוסדית עד מתת חסד (המוסדי הטיפול בבעלי חיים והנחיות ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטה הלאומית של סינגפור והוועדה הלאומית המייעצת למחקר בבעלי חיים מעבדה (NACLAR) הנחיות). 1. עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"...

<ol>
	<li>Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+matrices+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine+applications.">Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications.</a> Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).</li><li>Elenbaas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+cells+generated+by+oncogenic+transformation+of+primary+epithelial+cells.">Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells.</a> Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).</li><li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer's+disease.">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).</li><li>Lim, J., Dobson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+transfection+of+HUVEC+and+MEF+cells+using+DNA+complexes+with+magnetic+nanoparticles+in+an+oscillating+field.">Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field.</a> J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transduction+of+fibroblasts+and+mesenchymal+stem+cells+by+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+for+their+potential+use+in+cellular+therapy.">High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy.</a> Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).</li><li>Patel, M., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+reprogramming+somatic+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).</li><li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis:+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+luman+formation.">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li><li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound.">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li><li>Guo, S., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+wound+healing.">Factors affecting wound healing.</a> J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).</li><li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte-fibroblast+interactions+in+wound+healing.">Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing.</a> J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).</li><li>Shen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-derived+cytosolic+DNA+mediates+type+I+interferon-dependent+rejection+of+B+cell+lymphoma+cells.">Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells.</a> Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Baglole, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+phenotypic+characterization+of+lung+fibroblasts.">Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts.</a> Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).</li><li>Alt, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+share+mesenchymal+phenotypes+with+stem+cells,+but+lack+their+differentiation+and+colony-forming+potential.">Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential.</a> Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).</li><li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+culture+of+cells+from+mouse+tail+biopsies:+brief+communication.">A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication.</a> J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).</li><li>Moore, C. B., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ear+fibroblast+derivation+from+mice.">Primary ear fibroblast derivation from mice.</a> Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+pluripotent+stem+cells+from+NOD+mouse+tail-tip+fibroblasts.">Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts.</a> Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).</li></ol>

כאן אנו מספקים הליך ניסוי פשוט, זול ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. החילוץ צריך לגרום fibroblasts החלוקה חסיד ומהירות תוך 3 ימים לאחר בידוד של הרקמה. מגבלה חשובה של תאים ראשוניים היא הזדקנות, מעצר צמיחה קבוע 15. שימוש בפרוטוקול, ניתן ...

תאים ראשוניים נגזרים מרקמת חיה ותרבותית בתנאים במבחנה. מקובל להניח כי תאים ראשוניים דומים למצב הפיזיולוגי ורקע גנטי של הרקמה שממנו הם מקורו משורות תאים הונצחו או גידול 1 באופן הדוק יותר. מסיבה זו, תאים ראשוניים מייצגים מודל שימושי לחקר 2,3 שאלות ביולוגי. עם זאת, בניגוד לשורות תאים קבעו כי לגדול ללא הגבלת זמן, תאים ראשוניים סופו של דבר לעבור הזדקנות בתרבות ובצריכים להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה. תאים ראשוניים נפוצים כוללים fibroblasts, תאי אפיתל, תאי אנדותל, תאי T, תאי B, מקרופאגים נגזר מח עצם (BMDM) ותאים דנדריטים נגזר מח עצם (BMDC). Fibroblasts לעתים קרובות מנוצלים כמודל תרבית תאים ראשוניים. הם מציעים יתרונות מרכזיים על פני תאים ראשוניים אחרים. תרביות תאים בקלות הוקמו, מתוחזק בקלות ולא דורשות purification של תאים לפני התרבות. יש להם תפוצה ראשונית מהירה ואין דרישה לפרוטוקולים בינוניים או הפעלה מיוחדות. Fibroblasts ניתן transfected ביעילות באמצעות ביולוגי, כימי, ופרוטוקולים פיזיים 4,5. יש אפשרות לאחסן את האוזניים של עד 10 ימים בRT לפני הקמת תרביות תאים. תרבויות פיברובלסטים הם תורמים להדמיה של תהליכי cytoplasmic ומתאימים לתכנות מחדש לתאי גזע pluripotent המושרה (iPS) 6. פיברובלסטים הם תאים חשובים של רקמת החיבור שמפרישים חלבוני קולגן ומטריקס 7. הם מספקים את המסגרת המבנית ברקמות רבות 8 ולשחק תפקיד חיוני בריפוי פצעים ו9,10 תיקון רקמות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומהיר (&lt;4 שעות) להקים תרבויות פיברובלסטים מאוזניים וזנבות של עכברים 11. הפרוטוקול מחייב עכבר מינימאליניסיון לקצור את הרקמות (בניגוד לפרוטוקולים אחרים 12,13) ​​וניתן להשתמש בם כדי להקים תרבויות מאוזניים מאוחסנות במדיום ב RT לעד 10 ימים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SH30027.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Asparagine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">107017</td>
			<td>Absolute for analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:140px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">11088866001</td>
			<td>From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pronase protease</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">53702</td>
			<td>From Streptomyces griseus&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris buffer (pH 8)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">1415</td>
			<td>Ultra pure grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5M EDTA (pH 8)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">BUF-1053</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2040-10X4L</td>
			<td>Ultra pure grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution 10X</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">59418C-100ML</td>
			<td>0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2492-20ml</td>
			<td>250 &#956;g/ml in deionized water, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissors</td>
			<td style="width:140px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcep</td>
			<td style="width:140px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">AE-BD312R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#956;M syringe filter</td>
			<td style="width:140px;">Sartorius Stedim</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70 &#956;M cell strainer</td>
			<td style="width:140px;">SPL</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe plunger</td>
			<td style="width:140px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS+10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryovial tube</td>
			<td style="width:140px;">NUNC</td>
			<td style="width:119px;">368362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.7 ml microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:140px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm cell culture dish</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">664160</td>
			<td>Cell culture treated dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical bottom tube</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 ml conical bottom tube</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water bath</td>
			<td style="width:140px;">GFL</td>
			<td style="width:119px;">1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubation shaker</td>
			<td style="width:140px;">Sartorius Stedim</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Certomat-BS1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axiovert 25 light microscope</td>
			<td style="width:140px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues

תאים ראשוניים נגזרים ישירות מהרקמה ונחשבים לנציג נוסף של המצב הפיזיולוגי של תאים בגוף חי משורות תאים הוקמו. עם זאת, יש לי תרביות תאים ראשוניות בדרך כלל אורך חיים סופי וצריכה להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה. פיברובלסטים הם מקור נגיש של תאים ראשוניים. כאן, אנו דנים בהליך ניסיוני פשוט ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי להקים תרבויות עיקריות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים. כאשר הפרוטוקול ואחריו בזהירות, זיהומים צפויים להתרחש למרות השימוש ברקמות שאינן סטרילי מאוחסנות לזמן ממושך ובמקרים מסוימים. Fibroblasts להתרבות במהירות בתרבות ובניתן להרחיב למספרים משמעותיים לפני שעברנו הזדקנות replicative.

הפקה של fibroblasts מתוצאות רקמה בכמות משמעותית של רקמת פסולת (איור 1). בניגוד לפסולת רקמות, fibroblasts לדבוק משטחי פלסטיק בתרבית רקמה בין יום 1 ו -3 של התרבות. הבינוני של תרבויות פיברובלסטים ניתן לשנות בבטחה ביום 3 של תרבות, שאמור להקטין באופן משמעותי את הרמות של הווה פסו...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues at JoVE.com

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

אנו מתארים הליך ניסוי פשוט ומהיר ליצירת fibroblasts העיקרי מהאוזניים והזנבות של עכברים. ההליך אינו דורש הכשרה מיוחדת ובעלי חיים יכול לשמש לדור של תרבויות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים.

תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

The overall goal of this protocol is to establish primary fibroblast cultures from the ears and tail of mice. This method can help answer key questions in the cell biology field, such as the difference between healthy and cancer cells. The main advantage of this study is that we can generate fibroblast from ears that were stored in medium at room temperature for up to 10 days before isolating the cells.Though this method can provide insight into mouse biology, it can also be applied to other mammalian animal organisms such as rats and rabbits. Before collecting the tissues, load 10 centimeter culture dishes with 10 milliliters of complete medium. Then, after the mouse has been euthanized, proceed with using sterilized instruments to collect the tissue samples.Collect ear tissues with about a one centimeter radius, and collect about five centimeters of tail tissue. Transfer the tissues to a conical tube loaded with 40 milliliters of 70%ethanol. Let them soak for five minutes, and then air-dry them in an open 10 centimeter culture dish for five minutes in a culture hood.After the tissues dry, transfer them onto the media-loaded plate. Now, snip the hair off all the tissues using scissors, and then cut the tissues into pieces smaller than three millimeters. Transfer the diced tissue to cryotube vials, and then fill the vials with collagenase D pronase solution, to the 1.8 milliliter mark.Now incubate the tissues at 37 degrees Celsius, with shaking at 200 rpm for 90 minutes. At the hood, load a dish with 10 milliliters of complete medium. Over the dish, place a 70 micron cell strainer, and after the incubation, load the tissue digestion into the strainer.Now, grind the tissues in the strainer using a plunger. Do this for at least five minutes. Occasionally shake the strainer into the medium to wash out dissociated cells.It is important that the digested ear and tail tissues are ground out well in order to cull out a good number of cells. Also be sure to shake the cell strainer after grinding the tissues. This will wash out additional cells from the strainer.Next, collect the cell suspension in a 15 milliliter conical tube. Then, rinse the strainer with 10 milliliters of medium, and add the rinse solution to the collection. Now, wash the cells.Firstly, spin the cells down in a refrigerated centrifuge. Secondly, remove the supernatant. And thirdly, suspend the cells in 10 milliliters of complete medium.Repeat the wash once more, and finish the procedure with the cells in complete medium, ready for culturing. To culture the cells, first, transfer the cell suspensions to 10 milliliter culture dishes. Then, add 10 microliters of amphrotericin B solution to each culture.Now, incubate the cells for three days. On the third day, replace the medium with fresh complete medium with amphrotericin B.Soon after, the cultures will reach 70%confluency. At this point, remove the medium and rinse the culture with five milliliters of 1X PBS.Then, replace the PBS with two milliliters of 1X trypsin EDTA solution, and incubate the cells for five minutes. After the brief incubation, gently tap the dishes and add six milliliters of fresh complete medium to each dish. Now, pipette the released cells from the dish to two 15 milliliter conical tubes.Then, spin the tubes down for five minutes at 450 Gs in a refrigerated centrifuge. Resuspend the pellets in five milliliters of complete medium and measure the cell density of the suspensions. Now, feed the cells to 10 centimeter dishes at 200, 000 per dish.Incubate these cells for three to four days until they reach 70%confluency, and then repeat the process of collecting, and replating the cells at a specific density. They can be grown this way for up to 25 days. Three days after the cell extraction, there was significant debris in the culture before exchanging the medium.The cell debris is highlighted with white arrows. The scale bar represents 100 microns. New medium significantly reduced the cell debris.Three day old cultures produced from tissue that had been stored at room temperature for 10 days demonstrated that the fibroblasts are fairly hardy. From such tissues, 70 to 80%fibroblast confluency was achieved after five to six days. The cells were labelled with a marker for fibroblasts, vimentin, seen in red.DAPI was used to label the nuclei, which is seen in blue. The scale bar is 10 microns. The uniform staining suggests that the fibroblast culture is pure.The described protocol routinely got this result. After watching this video, you should have gotten this ending of how to quickly and reliably establish primary fibroblast cultures. While attempting this procedure, extra attention should be given during the extraction of fibroblasts from the tissues, as insufficient grinding of the tissue will result in lower cell numbers.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

הכנה לרקמה וכתמים של רקמות הגולגולת והעצמות הבלתי מתויטות

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

מעקב גנטי שבטים באמצעות עכבר קונפטי למחקר רקמות מינרליזציה

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

המיקרוגל והפלואורופפור-טירמידה לשימוש בחומרים מדומים על העכבר באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...