Name: high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension at JoVE.com

وأيد هذا العمل ماليا من المنح K22AI099165 (AWB)، P41GM103390 (KWM) وP01GM107012 (KWM) من المعاهد الوطنية للصحة، وبأموال من روي J. زارة كارفر الكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية في جامعة ولاية ايوا . مضمون هذا العمل هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للالمعاهد الوطنية للصحة.

هذا البروتوكول هو كاف للتعبير باستخدام HEK293F أو خلايا HEK293S. 1. خلية المؤسسة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة التلقيح ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات التلاعب الثقافة في منشأة BSL-2 وكل بند جلبت الى مجلس الوزراء للسلامة...

يوضح هذا البروتوكول البروتين التعبير عبر ترنسفكأيشن عابرة من الخلايا HEK293F أو S. شروط ترنسفكأيشن المثلى التي أنشئت في اذع والوفل مختبرات توظف مزيجا ينتقد تركيز كثافة الخلايا وكاشف لتحقيق عالية الكفاءة ترنسفكأيشن. الاعتبارات الهامة عند تنفيذ هذا البروتوكول ما يلي: ال?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

إنتاج غلة عالية من البروتينات البشرية مطوية بشكل مناسب وبعد translationally معدلة لتحليل مفصل للبنية ووظيفة لا يزال يشكل تحديا كبيرا. تتوفر التي تنتج البروتينات المؤتلف مع مثل مواطن وظيفة والسلوك وهناك عدد كبير من أنظمة التعبير. أنظمة التعبير البكتيرية، في الغالب سلالات الإشريكية القولونية، تمثل الأدوات التي يمكن الوصول إليها والتي يشيع استخدامها في المجال البحثي، نظرا لبساطة هذه الأنظمة التعبير، على الرغم من الخميرة، والنباتات والحشرات والثدييات أنظمة موصوفة 1-4 أيضا. ومع ذلك، فإن معظم هذه النظم غير قادرة على تعديل ما بعد متعدية المناسب من البروتينات المستهدفة. A المصالح الأساسية للمختبرات اذع والوفل تنتج بروتينات حقيقية النواة مع بالغليكوزيل المناسب. العديد من البروتينات البشرية تتطلب بالغليكوزيل المناسب للوظيفة المناسبة (انظر 5). في حقيقية النواةماكينات بالغليكوزيل واسعة النطاق وقادرة على صنع مجموعة متنوعة من التعديلات، بما في ذلك الأسباراجين (N) - وسيرين / ثريونين (O) -linked glycans معقدة 6. ويقدر أن&gt; 50٪ من البروتينات البشرية هي N-الغليكوزيلاتي 7. Glycans هي عناصر أساسية في العديد من البروتينات بما في ذلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة العلاجية، إرثروبويتين، وعوامل تخثر الدم مثل عامل التاسع، على سبيل المثال لا الحصر. على الرغم من وجود طرق متعددة لتحضير البروتينات بشكل مناسب N-الغليكوزيلاتي وتتراوح الاصطناعية بحتة 10/08، لchemoenzymatic 11-14 أو التعافي من أنظمة المؤتلف المهندسة 15-20، وليس من المستغرب، ونظم التعبير الإنسان وقد ثبت حتى الآن أن يكون أكثر قوة طرق لتوليد بروتينات بشرية. ويتم إنتاج العديد من بروتينات سكرية الإنسان العلاجية في أنظمة المؤتلف باستخدام خلايا الثدييات. نظم المذكرة هي الهامستر المبيض الصينية (CHO)، والماوس المايلوما (NS0)، بيبي الهامستر Kidneص (BHK)، الجنينية البشرية الكلى (HEK-293) وخطوط الخلايا في شبكية العين البشرية التي يعملون في الالتصاق أو التعليق الثقافة لإنتاج البروتين 4،21،22. ومع ذلك، فقد يتطلب أنظمة تعبير البروتين الثدييات جيل من خطوط الخلايا مستقرة، وسائط النمو مكلفة والركيزة ساعدت إجراءات ترنسفكأيشن 23. ويتحقق ترنسفكأيشن الخلية الثديية بمساعدة العديد من العوامل بما في ذلك الفوسفات الكالسيوم 24،25، والبوليمرات الموجبة (DEAE-ديكستران، polybrene، متعدد الليزين، polyethylimine (PEI)) أو الجسيمات الشحمية الموجبة موجبة الشحنة 26-29. PEI هو polycationic، اتهم، خطي أو البوليمر تشعبت (25 كيلو دالتون) 26 الذي يشكل مجمع مستقرة مع DNA وendocytosed. على تحمض الاندوسوم، ويعتقد PEI للتضخم، مما أدى إلى تمزق الإندوسومات والإفراج عن الحمض النووي في السيتوبلازم 26،30. حتى وقت قريب، ترنسفكأيشن عابرة في suspensiعلى الثقافة كان يحملها الحمض النووي / PEI تشكيل معقد مسبق يليه بالإضافة إلى زراعة الخلايا 29. ومع ذلك، ذكرت ورم وزملاء العمل بروتوكول كفاءة عالية الأمثل لإنتاج البروتين المؤتلف في الخلايا HEK293 التي شكلت مجمع DNA / جزيرة الأمير إدوارد في الموقع 31،32. تجنب هذا الإعداد والتعقيم للمجمع، وتبادل عازلة في مستنبت. مزيد من التحسين من قبل بما في ذلك البلازميدات المعززة للتعبير أدى إلى زيادة العائد الكبير 33. هنا هو الطريقة التي يبني عليها هذه السلف وغير قابلة للتطبيق على نطاق واسع. ويمكن أيضا أن تتغير الظروف التعبير للتأثير على تكوين-N غليكان. خط الخلية HEK293S، مع حذف الجينات التي توقف تجهيز N-غليكان في مرحلة وسيطة، ويؤدي إلى التعبير عن البروتينات مع الزي N-glycans يتكون من 2 بقايا N-acetylglucosamine بالإضافة إلى خمسة بقايا المانوز (مان 5 GlcNAc 2) 34، 35. هذه الخلاياتفتقر إلى ترانسفيراز N-acetylglucosaminyl I (GntI) الجين الذي هو مطلوب للالمصب-N غليكان معالجة 36،37. استخدام مثبطات ناقلة الغليكوزيل بما في ذلك kifunensine، النظير الحامض اللعابي وفوكوسي التناظرية و2-ديوكسي-2-الفلورية فوكوسي له تأثيرات وحدود المعالجة N-غليكان 38-41 مماثلة. ذكرت بروتوكول هنا يستخدم ناقل pGEn2 كما هو مبين في الشكل 1 42،43، PEI بمساعدة ترنسفكأيشن عابرة إلى خطوط خلايا الثدييات (HEK293F أو خلايا HEK293S)، واسترداد عوائد عالية من البروتين الغليكوزيلاتي بشكل مناسب. هذا النظام هو قوي ويمكن أن تستوعب عوامل مختلفة بما في ذلك وضع العلامات النظائر والهندسة غليكان لإنتاج التتر كبيرة من البروتينات المؤتلف.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>CellGard ES NU-S475-400</td>
			<td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation shaker</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Multitron Cell&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>14571C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeStyle HEK 293F Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (Pipet-Aid XP)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>161263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slides&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>23966</td>
			<td>Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 &#956;M syringe filter and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>EMD Chemicals Inc.</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Syringe Filter, 0.22 &#956;M</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisaminomethane (Tris base)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>222249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Analytical&#160;</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH chemicals</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic (VPA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4543</td>
			<td>Prepare stock solution of 220 mM&#160; in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#63720; 250 mL Centrifuge Tube&#160;</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EW-17707-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A-Sepharose column</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa molecular weight cut-off Amicon&#174; Ultra centrifugal filters&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial&#160;</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie brilliant blue&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Tyrosine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>332151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Lysine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>592900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled L-Phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-Glucose</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-2-fluoro-l-fucose&#160;</td>
			<td>SANTA CRUZ Biotechnology</td>
			<td>sc-283123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension

فن إنتاج البروتينات المؤتلف مع بعض التعديلات بعد متعدية معقدة يمثل تحديا كبيرا للدراسات البنية والوظيفة. إنشاء السريع واسترداد عالية من خطوط الخلايا الثديية عابر.، ويتناول هذا الحاجز ويشكل وسيلة فعالة للتعبير عن البروتينات التي يتم توجيهها بشكل طبيعي من خلال ER ومسار إفرازية بوساطة جولجي. هنا هو بروتوكول واحد للتعبير البروتين باستخدام HEK293F البشرية وخطوط الخلايا HEK293S مع transfected متجه التعبير الثدييات مصممة لعوائد عالية من البروتين. مدى انطباق هذا النظام كما يتجلى ذلك باستخدام ثلاثة بروتينات سكرية التمثيلية التي أعربت عن ذات العوائد بين 95-120 ملغ من البروتين المنقى تعافى للتر الواحد من الثقافة. هذه البروتينات هي FcγRIIIa البشرية وsialyltransferase الفئران α2-6، ST6GalI، سواء أعرب مع GFP الانصهار N-محطة، وكذلك الغلوبولين المناعي البشري معدلة G1 لكرة القدم. هذا النظام يده قويةlizes وسيلة خالية من المصل التي هي قابلة للتكيف للتعبير عن البروتينات والكربوهيدرات للدراسات الهيكلية باستخدام مطياف الكتلة والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي المخصب نظائريا. وعلاوة على ذلك، تكوين N-غليكان يمكن ضبطها من خلال إضافة جزيء صغير لمنع بعض التعديلات غليكان بطريقة لا يقلل من العائد.

تعبير البروتين رفيع المستوى والنقاء هذا النظام التعبير الأمثل ولدت عالية الغلة من البروتينات الغليكوزيلاتي. ويرد النمط المعتاد في التعبير عن IgG1-FC (الشكل 1). في هذه الحالة، يوم 0 هو اليو...

Watch this Scientific Journal Video about High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension at JoVE.com

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

ارتفاع العائد التعبير عن البروتينات المؤتلف الإنسان مع عابر ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 في تعليق

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

إنتاج النسخ المعيبة للفيروسات الارتدادية التي ترنسفكأيشن عابر للخلايا 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

التعبير عن البروتينات المؤتلف في الخميرة Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

مطلق قياس العائد الكم من عينات مسحوق

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

ومنهاج عمل مريحة والتعبير العام لانتاج البروتينات يفرز من خلايا الإنسان

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration كفاءة من النباتات للتعبير عابر الرفيع المستوى من البروتينات المؤتلف

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...