Name: high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalle sovvenzioni K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) e P01GM107012 (KWM) dal National Institutes of Health, e da fondi del Roy J. Carver Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Biologia Molecolare presso la Iowa State University . Il contenuto di questo lavoro è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NIH.

Questo protocollo è sufficiente per l&#39;espressione utilizzando HEK293F o cellule HEK293S. 1. Istituzione cellulare <ol><li> Cultura Inoculazione Nota: Tutte le procedure di coltura di manipolazione devono essere effettuate in una struttura BSL-2 ed ogni articolo portato nel cabinet biosicurezza devono essere sterilizzati a spruzzo con etanolo al 70% in soluzione acquosa. <ol><li> Azionare l&#39;agitatore incubatore a 135 giri al minuto, l&#39;80% di umidità e al 8,0% di CO 2 e 37 ° C. T...

Questo protocollo illustra l&#39;espressione della proteina tramite la trasfezione transiente di cellule HEK293F o S. Le condizioni ottimali di trasfezione stabilite nei laboratori Barb e Moremen utilizzano una combinazione critica di concentrazioni di densità delle cellule e reagenti per ottenere un&#39;elevata efficienza di trasfezione. Considerazioni critiche in sede di attuazione di questo protocollo sono: il mantenimento di una cultura stabile prima di trasfezione (con la cultura coerente tempi raddoppio); trasfez...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Produrre rese elevate di proteine ​​umane opportunamente piegati e post-traduzionali modificati per l&#39;analisi dettagliata della struttura e della funzione rimane una sfida significativa. Un gran numero di sistemi di espressione sono disponibili che producono proteine ​​ricombinanti con funzione e il comportamento di tipo nativo. Sistemi di espressione batterici, prevalentemente ceppi Escherichia coli, rappresentano gli strumenti più accessibili e più comunemente utilizzati in ambito di ricerca, grazie alla semplicità di questi sistemi di espressione, però lieviti, piante, insetti e mammiferi sono anche descritti 1-4. Tuttavia, la maggior parte di questi sistemi sono incapaci di appropriate modificazione post-traduzionale di proteine ​​bersaglio. Un interesse fondamentale dei laboratori Barb e Moremen sta producendo proteine ​​eucariotiche con un&#39;adeguata glicosilazione. Molte proteine ​​umane richiedono glicosilazione appropriato per il corretto funzionamento (vedi punto 5). Il eucarioticamacchine glicosilazione è ampia e in grado di fare una vasta gamma di modifiche, tra cui sia asparagina (N) - e serina / treonina (O) linked glicani complessi 6. Si stima che&gt; 50% di proteine ​​umane sono N-glicosilata 7. Glicani sono componenti essenziali di molte proteine, tra cui gli anticorpi monoclonali terapeutici, eritropoietina, e fattori di coagulazione del sangue come fattore IX, per citarne alcuni. Anche se esistono diversi metodi per preparare adeguatamente le proteine ​​N-glicosilata e vanno dal puramente sintetica 8-10, a chemoenzimatica 11-14 o il recupero dai sistemi ricombinanti ingegnerizzati 15-20, non a caso, sistemi di espressione umane hanno finora dimostrato di essere il più robusto metodi per generare proteine ​​umane. Molti glicoproteine ​​umani terapeutiche sono prodotte in sistemi ricombinanti utilizzando cellule di mammifero. Sistemi di nota sono l&#39;ovaio di criceto cinese (CHO), mouse mieloma (NS0), Baby Hamster Kidney (BHK), embrionale umano Rene (HEK-293) e linee di cellule retiniche umane che sono impiegati in adesione o la sospensione di coltura per la produzione di proteine ​​4,21,22. Tuttavia, sistemi di espressione di proteine ​​di mammifero hanno richiesto la generazione di linee cellulari stabili, terreni di crescita costosi e substrato assistita procedure di trasfezione 23. Trasfezione di cellule di mammifero è realizzato con l&#39;ausilio di numerosi agenti, tra cui fosfati di calcio 24,25, polimeri cationici (DEAE-destrano, polibrene, polilisina, polyethylimine (PEI)) o caricati positivamente liposomi cationici 26-29. PEI è un policationico, carica, lineare o ramificato polimero (25 kDa) 26 che forma un complesso stabile con il DNA ed è endocitosi. Dopo acidificazione del endosome, PEI è pensato a gonfiarsi, portando alla rottura di endosomi e liberazione del DNA nel citoplasma 26,30. Fino a poco tempo, trasfezione transiente in suspensisulla cultura è stata effettuata previo formazione del complesso DNA / PEI seguita tramite aggiunta alla coltura cellulare 29. Tuttavia, Würm e collaboratori hanno riportato un protocollo altamente efficiente ottimizzato per la produzione di proteine ​​ricombinanti in cellule HEK293 che formavano un complesso DNA / PEI in situ 31,32. Ciò ha evitato preparazione, sterilizzazione del complesso, e scambio di tamponi in un terreno di coltura. Ulteriore ottimizzazione includendo plasmidi di espressione di miglioramento ha portato ad aumenti di rendimento significativo 33. Qui è un metodo che si basa su questi progressi ed è ampiamente applicabile. Condizioni di espressione può anche essere modificati per influenzare la composizione N-glicani. La linea cellulare HEK293S, con una delezione del gene che blocca trasformazione di N-glicani in una fase intermedia, porta alla espressione di proteine ​​con uniformi N-glicani composto da 2 residui N-acetilglucosamina più cinque residui di mannosio (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Queste cellulemanca la transferasi N-acetylglucosaminyl I (GntI) gene che è richiesto per N-glicani lavorazione a valle 36,37. L&#39;uso di inibitori glicosiltransferasi compreso kifunensine, analoghi di acido sialico e fucosio analogico e 2-deossi-2-fluoro-fucosio ha effetti simili e limiti di lavorazione N-glicani 38-41. Il protocollo qui riportato utilizza il vettore pGEn2 come mostrato in Figura 1 42,43, PEI assistito trasfezione transiente in cellule di mammifero (linee HEK293F o cellule HEK293S), e il recupero di alte rese di proteine ​​opportunamente glicosilata. Questo sistema è robusto e può ospitare diversi fattori tra cui marcatura isotopica e l&#39;ingegneria glycan per la produzione di grandi titoli di proteine ​​ricombinanti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>CellGard ES NU-S475-400</td>
			<td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation shaker</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Multitron Cell&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>14571C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeStyle HEK 293F Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (Pipet-Aid XP)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>161263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slides&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>23966</td>
			<td>Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 &#956;M syringe filter and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>EMD Chemicals Inc.</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Syringe Filter, 0.22 &#956;M</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisaminomethane (Tris base)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>222249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Analytical&#160;</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH chemicals</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic (VPA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4543</td>
			<td>Prepare stock solution of 220 mM&#160; in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#63720; 250 mL Centrifuge Tube&#160;</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EW-17707-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A-Sepharose column</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa molecular weight cut-off Amicon&#174; Ultra centrifugal filters&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial&#160;</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie brilliant blue&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Tyrosine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>332151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Lysine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>592900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled L-Phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-Glucose</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-2-fluoro-l-fucose&#160;</td>
			<td>SANTA CRUZ Biotechnology</td>
			<td>sc-283123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension

L&#39;arte di produrre proteine ​​ricombinanti con complesse modificazioni post-traslazionali rappresenta una sfida importante per gli studi di struttura e funzione. L&#39;istituzione rapida ed elevata recupero da linee cellulari di mammiferi transiente transfettate indirizzi questa barriera ed è un mezzo efficace per esprimere le proteine ​​che sono naturalmente incanalati attraverso l&#39;ER e Golgi-mediata via secretoria. Qui è un protocollo per l&#39;espressione della proteina con il HEK293F umano e linee cellulari HEK293S transfettate con un vettore di espressione di mammifero progettato per rese elevate di proteine. L&#39;applicabilità di questo sistema è dimostrata utilizzando tre glicoproteine ​​rappresentative che hanno espresso con rese tra 95-120 mg di proteina purificata recuperato per litro di cultura. Queste proteine ​​sono la FcγRIIIa umana e sialyltransferase α2-6 ratto, ST6GalI, sia espressa con una fusione GFP N-terminale, così come la immunoglobulina umana non modificato G1 Fc. Questo robusto sistema utilizes un mezzo privo di siero che è adattabile per l&#39;espressione di proteine ​​e carboidrati per studi strutturali mediante spettrometria di massa e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare isotopicamente arricchiti. Inoltre, la composizione della N-glicani può essere regolato aggiungendo una piccola molecola di evitare talune modifiche glicani in modo che non riduca la resa.

Espressione della proteina ad alto livello e la purezza Questo sistema di espressione ottimizzato generato un alto rendimento di proteine ​​glicosilate. Un modello tipico è mostrato nell&#39;espressione di IgG1-Fc (Figura 1). In questo caso, Giorno 0 è il giorno trasfezione seguito da Day 1 (diluizione) e nei giorni successivi della cultura fino al giorno 5. espressione della proteina viene analizzata ut...

Watch this Scientific Journal Video about High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension at JoVE.com

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Ricerca

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Espressione di proteine ​​ricombinanti nel lievito Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Absolute Quantum la misurazione del rendimento dei campioni di polvere

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Una piattaforma espressione conveniente e generale per la produzione di proteine ​​secrete da cellule umane

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

High Yield Espressione di proteine ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione