Name: high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension at JoVE.com

Эта работа была выполнена при финансовой поддержке грантами K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) и P01GM107012 (KWM) из Национального института здоровья, и средств от Роя Дж Carver Департамента биохимии, биофизики и молекулярной биологии в Университете штата Айова , Содержание данной работы является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.

Этот протокол является достаточным для выражения с использованием либо HEK293F или HEK293S клетки. 1. Создание сотовый <ol><li> Культура Прививка Примечание: Все процедуры манипулирования культуры должно осуществляться в BSL-2 объекта, и каждый пункт принес в кабинет биобезопасности долж...

Этот протокол иллюстрирует экспрессию белка с помощью переходного трансфекции HEK293F или S клеток. Оптимальные условия трансфекции, установленные в лабораториях Барб и Moremen использовать критическую комбинацию плотности клеток и реагентов концентрации для достижения высокой эффективн?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Производство высокие урожаи соответствующим сложенными и посттрансляционно модифицированных белков человека для детального анализа структуры и функции остается серьезной проблемой. Большое количество систем экспрессии доступны, которые производят рекомбинантные белки с нативной как функции и поведение. Бактериальные системы экспрессии, преимущественно кишечной палочки штамма, представляют собой наиболее доступных и широко используемых инструментов в научно-исследовательской сфере, в связи с простотой этих систем экспрессии, хотя дрожжи, растения, насекомых и млекопитающих систем также описаны 1-4. Тем не менее, большинство из этих систем не способны соответствующим посттрансляционной модификации белков-мишеней. Фундаментальный интерес лабораториях Барб и Moremen производит эукариотических белков с соответствующей гликозилирования. Многие белки человека требуют соответствующего гликозилирования для правильного функционирования (см 5). Эукариотическийгликозилирования техника обширна и способны сделать широкий спектр модификаций, в том числе как аспарагин (N) - и серина / треонина (О) -связанной сложные гликаны 6. Считается, что&gt; 50% человеческих белков N-гликозилированные 7. Гликаны являются важными компонентами многих белков, включая терапевтические моноклональные антитела, эритропоэтин, и факторов свертывания крови, как фактор IX, чтобы назвать несколько. Хотя несколько методов существуют, чтобы подготовить соответствующим образом N-гликозилирования белков и варьируются от чисто синтетических 8-10, чтобы chemoenzymatic 11-14 или восстановление из инженерных рекомбинантных системах 15-20, не удивительно, что системы человека выражение до сих пор доказано, что самый надежный методы для генерации человеческих белков. Многие терапевтические человека гликопротеины производятся в рекомбинантных системах, использующих клетки млекопитающих. Системы следует отметить яичника китайского хомячка (СНО), мышиной миеломы (ns0), хомячка Kidneу (ВНК), человеческого эмбриона почек (НЕК-293) и сетчатки клеточных линий человека, которые используются в адгезии или суспензионной культуры для производства белка 4,21,22. Тем не менее, системы экспрессии белка млекопитающего требовали генерацию стабильных клеточных линий, дорогих питательной среды и подложки помощь процедур трансфекции 23. Млекопитающих трансфекции клеток достигается с помощью многочисленных агентов, включая фосфатов кальция 24,25, катионных полимеров (DEAE-декстран, полибрен, полилизин, polyethylimine (PEI)) или положительно заряженных катионные липосомы 26-29. PEI является поликатионное, загружают, линейный или разветвленный полимер (25 кДа), который формирует 26 стабильный комплекс с ДНК и эндоцитоз. При подкислении эндосомы, PEI, как полагают, набухают, что приводит к разрыву эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму 26,30. До недавнего времени, временная трансфекция в suspensiна культуру проводилась по предварительной ДНК / PEI комплексообразования с последующим добавлением к культуре клеток 29. Тем не менее, Würm и соавторы сообщили весьма эффективный протокол, оптимизированный для рекомбинантного белка в клетках НЕК293, которые сформировали комплекс ДНК / PEI в месте 31,32. Это препарат, избежать стерилизации комплекса, и буфера обмена в культуральной среде. Дальнейшая оптимизация путем включения экспрессии плазмиды, повышающих привели к значительным увеличением доходности 33. В этом метод, который основывается на этих авансов и широко применим. Условия экспрессии также могут быть изменены, чтобы повлиять на состав N-гликанов. Клеточная линия HEK293S, с делеции гена, что останавливает N-гликана обработки на промежуточном этапе, приводит к экспрессии белков с единых N-гликанов, состоящих из 2 N-ацетилглюкозамина остатков плюс пять остатков маннозы (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Эти клеткине хватает N-ацетилглюкозаминил трансферазы I (GntI) ген, который требуется для последующего N-гликанов обработки 36,37. Применение ингибиторов гликозилтрансферазы включая kifunensine, аналогов сиаловой кислоты и фукозы аналоговых и 2-дезокси-2-фтор-фукозы имеет подобные эффекты и ограничения N-гликанов обработки 38-41. Протокол сообщалось здесь, использует вектор pGEn2, как показано на рисунке 1 42,43, PEI трансфекции помощь переходные в клетки линий (HEK293F или HEK293S клеток), а также восстановление с высоким выходом соответственно гликозилированный белок. Эта система является надежной и может использоваться для различных факторов, включая изотопной метки и гликановой техники для производства больших титров рекомбинантных белков.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>CellGard ES NU-S475-400</td>
			<td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation shaker</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Multitron Cell&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>14571C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeStyle HEK 293F Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (Pipet-Aid XP)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>161263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slides&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>23966</td>
			<td>Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 &#956;M syringe filter and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>EMD Chemicals Inc.</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Syringe Filter, 0.22 &#956;M</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisaminomethane (Tris base)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>222249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Analytical&#160;</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH chemicals</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic (VPA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4543</td>
			<td>Prepare stock solution of 220 mM&#160; in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#63720; 250 mL Centrifuge Tube&#160;</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EW-17707-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A-Sepharose column</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa molecular weight cut-off Amicon&#174; Ultra centrifugal filters&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial&#160;</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie brilliant blue&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Tyrosine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>332151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Lysine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>592900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled L-Phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-Glucose</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-2-fluoro-l-fucose&#160;</td>
			<td>SANTA CRUZ Biotechnology</td>
			<td>sc-283123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension

Искусство получения рекомбинантных белков со сложными пост-трансляционных модификаций представляет собой серьезную проблему для исследований структуры и функции. Быстрое создание и высокое извлечение из временно трансфецированных клеточных линий млекопитающих обращается этот барьер и является эффективным средством выражения белки, которые, естественно, направлен через ER и Гольджи-опосредованной секреторной пути. Вот один протокол для экспрессии белка с использованием человеческого и HEK293F HEK293S клеточные линии, трансфицированные экспрессирующий вектор млекопитающего, предназначенный для высоких урожаев белка. Применимость этой системы продемонстрировали с помощью трех представительных гликопротеинов, которые выразили при урожайности между 95-120 мг очищенного белка восстановленного на литр культуры. Эти белки являются человеческий FcγRIIIa и крыс α2-6 сиалилтрансферазу, ST6GalI, как выражается с N-концевой GFP слияния, а также немодифицированного человеческого иммуноглобулина G1 Fc. Это надежные системы ИМПlizes бессывороточной среды, что является гибкой для выражения изотопно обогащенных белков и углеводов для структурных исследований с использованием масс-спектрометрии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Кроме того, в состав N-гликанов может быть настроена путем добавления небольшого молекулу, чтобы предотвратить определенные модификации гликанов таким образом, чтобы не уменьшить выход.

Экспрессия белка высокого уровня и чистоты Эта оптимизированная система экспрессии генерируется высокий выход гликозилированного белков. Типичный образец показан в выражении IgG1-Fc (рисунок 1). В этом случае день 0 в день транс...

Watch this Scientific Journal Video about High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension at JoVE.com

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Экспрессия рекомбинантных белков человека с временной трансфекции клеток НЕК293 в виде суспензии

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Производство репликации ретровируса Дефектные от переходных Трансфекция 293T клетки

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Экспрессия рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжей Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Оптимизированная стратегия Трансфекция для выражения и Электрофизиологические Запись рекомбинантных напряжением ионные каналы в НЕК-293T Клетки

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Абсолютный квантовый выход Измерение порошковых проб

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Удобный и общее выражение платформы для производства секретируемых белков из клеток человека

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Высокая пропускная способность очистки Affinity с метками рекомбинантных белков

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Эффективное Агроинфильтрация растений для высокого уровня переходных Экспрессия рекомбинантных белков

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Высокая пропускная количественном выражении Скрининг и очистка Применительно к рекомбинантный дисульфид-богатые Venom белков, продуцируемых в<em&gt; Е. палочка</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...