Name: high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension at JoVE.com

Bu çalışma mali hibe K22AI099165 (AWB) tarafından, P41GM103390 (KWM) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri P01GM107012 (KWM) ve Iowa State Üniversitesi Biyokimya, Biyofizik ve Moleküler Biyoloji Roy J. Carver Bölümü fonları tarafından desteklenen . Bu çalışmanın içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Bu protokol, HEK293F ya HEK293S hücreleri kullanılarak ekspresyon için yeterlidir. 1. Hücre kurulması <ol><li> Kültür Aşılama Not: Tüm kültür işleme prosedürleri BSL-2 tesisinde yapılabilir ve her bir madde, su çözeltisi içerisinde% 70 etanol ile püskürtülerek sterilize edilmelidir biyo-güvenlik kabinine getirdi. <ol><li> 135 rpm, 80% nemde kuluçka çalkalayıcı çalıştırın ve% 8.0 CO2 ve 37 ° C&#39;de ilave edildi. Çalışma için en az 1 saat önce biyogüvenli...

Bu protokol, HEK293F veya S hücrelerinin kısa süreli transfection ile protein ifadesini gösterir. Barb ve Moremen laboratuarlarında kurulan optimum transfeksiyon koşulları yüksek verim elde etmek için transfeksiyon hücre yoğunluğu ve reaktif konsantrasyonları kritik bir kombinasyonunu kullanır. Bu protokolü uygulayan Kritik hususlar şunlardır: (tutarlı kültür süreleri katlama) ile transfeksiyon öncesinde istikrarlı bir kültür muhafaza etmek; % 95&#39;den daha büyük hücre yaşayabilirliği ile...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Yapı ve fonksiyonunun ayrıntılı analizi için uygun katlanmış ve translasyon sonrası değiştirilmiş insan proteinlerinin yüksek verim üreten önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Ekspresyon sistemleri çok sayıda yerel benzeri fonksiyonu ve davranışı ile yeniden birleştirici proteinlerin üretmek mevcuttur. Maya, bitki, böcek ve memeli sistemleri, aynı zamanda 1-4 tarif olsa Bakteriyel ekspresyon sistemleri, esas olarak, Escherichia coli suşu, bağlı, bu sentezleme sistemlerinden basitliği, araştırma alanında en kolay ve yaygın olarak kullanılan araçlar temsil etmektedir. Bununla birlikte, bu sistemler büyük çoğunluğu hedef proteinlerin uygun post-translasyonel modifikasyon, Ulus. Barb ve Moremen laboratuvarlarının temel bir ilgi uygun glikosilasyona ile ökaryotik proteinleri üretiyor. Birçok insan proteinleri (5 bakınız) düzgün işlev için uygun glikozilasyonu gerektirir. Ökaryotglikosilasyon makineleri yaygın ve her iki asparagin (N) de dahil olmak üzere, modifikasyon bir yelpazede yapma yeteneğine sahiptir - ve serin / treonin (O) kompleksi glikanları 6 -bağlı. İnsan proteinlerinin&gt;% 50 7, N-glikosile olduğu tahmin edilmektedir. Glıkanlar birkaç isim faktör IX gibi terapötik monoklonal antikorlar, eritropoietin ve kan pıhtılaşma faktörleri gibi birçok proteinin temel bileşenleri vardır. Birden çok yöntem uygun N-glikosile proteinlerin hazırlamak için var ve 8-10 tamamen sentetik aralığı olsa da, en sağlam olması şaşırtıcı insan ifade sistemleri bugüne kadar kanıtlanmış değil mühendislik rekombinant sistemlerinden 15-20, 11-14 den veya kurtarma chemoenzymatic için insan proteinlerini üretmek için yöntemler. Bir çok tedavi edici insan glikoproteinleri, memeli hücreleri kullanılarak yeniden birleştirici sistemlerde üretilmektedir. Not sistemleri Çin Hamster Yumurtalık (CHO), fare miyelom (ns0), bebek hamster Kidne olany (BHK), insan embriyonik böbrek (HEK-293), ve protein üretimi 4,21,22, yapıştırma veya süspansiyon kültürü içinde kullanıldığında insan retinal hücre çizgileri. Ancak, memeli protein ekspresyon sistemleri Kararlı hücre çizgileri, pahalı bir büyüme ortamı ve alt-tabaka destekli transfeksiyon prosedürleri 23 nesil gerektirmiştir. Memeli hücre transfeksiyonu, kalsiyum fosfat 24,25, katiyonik polimerler (DEAE-dekstran, polibren, polilisin, polyethylimine (PEI)) ya da pozitif yüklü katyonik lipozomlar 26-29 dahil olmak üzere sayısız maddelerin yardımı ile elde edilmektedir. PEI, bir polikatyonik yüklü, doğrusal ya da DNA ile kararlı bir kompleks oluşturur ve endositoz dallı bir polimer (25 kDa) 26 dır. Endozomun asitleştirme üzerine, PEI sitoplazma 26,30 içine endozomlarda DNA salım yırtılmasına yol şişmeye düşünülmektedir. Suspensi yakın zamana kadar, geçici transfeksiyonkültürü, hücre kültürü 29 ek olarak, ardından önceden DNA / PEI kompleks formasyon ile gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, Würm ve çalışma arkadaşları, in situ 31,32 bir DNA / PEI kompleks oluşturduğu HEK293 hücrelerinde rekombinant protein üretim için optimize edilmiş bir yüksek verimli bir protokol bildirilmiştir. Bu kültür ortamı içine hazırlanmasını, kompleks sterilizasyon ve tamponu değiştirmek kaçınılmalıdır. Önemli verim artışları 33 neden ifade arttırıcı plazmidler dahil ederek daha ileri optimizasyon. Burada, bu ilerlemelere üzerine inşa ve geniş çapta uygulanabilir bir yöntemdir. İfade koşulları da N-glikan bileşimin etkisi için değiştirilebilir. Bir ara aşamasında N-glikan işlem durur bir gen silme ile HEK293S hücre çizgisi, (GIcNAc 2 Adam 5) 34 2, N-asetilglukozamin bakiyelerine artı beş mannoz kalıntılarının oluşturduğu homojen N-glikanların proteinlerin ekspresyonuna yol açar 35. Bu hücreler,N-asetilglukosaminiltransferaz I transferaz (GntI) alt N-glikan işleme 36,37 için gerekli olan geni içermezler. Kifunensine, sialik asit analoglarının ve fukoz analog ve 2-deoksi-2-floro-fukoz içeren glıkosıltransferaz inhibitörlerinin kullanımı benzer etkiler ve N-glikan işlem 38-41 sınırları vardır. Protokol Burada bildirilen, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi 42,43 pGEn2 vektörü kullanır PEI yardımıyla geçici memeli hücreleri çizgileri (HEK293F ya HEK293S hücreleri) transfeksiyon, ve uygun bir şekilde glikosile protein, yüksek verimlerle geri kazanılması. Bu sistem, sağlamdır ve rekombinant proteinlerin büyük titrelerinin üretimi için izotop işaretleme ve glikan mühendisliği de dahil olmak üzere çeşitli faktörler barındırabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>CellGard ES NU-S475-400</td>
			<td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation shaker</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Multitron Cell&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>14571C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeStyle HEK 293F Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (Pipet-Aid XP)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>161263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slides&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>23966</td>
			<td>Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 &#956;M syringe filter and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>EMD Chemicals Inc.</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Syringe Filter, 0.22 &#956;M</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisaminomethane (Tris base)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>222249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Analytical&#160;</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH chemicals</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic (VPA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4543</td>
			<td>Prepare stock solution of 220 mM&#160; in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#63720; 250 mL Centrifuge Tube&#160;</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EW-17707-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A-Sepharose column</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa molecular weight cut-off Amicon&#174; Ultra centrifugal filters&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial&#160;</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie brilliant blue&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Tyrosine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>332151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Lysine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>592900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled L-Phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-Glucose</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-2-fluoro-l-fucose&#160;</td>
			<td>SANTA CRUZ Biotechnology</td>
			<td>sc-283123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension

Karmaşık post-translasyonel modifikasyonlar ile rekombinant proteinlerin üretilmesi teknolojisi yapı ve fonksiyon çalışmaları için büyük bir sorun teşkil etmektedir. Geçici olarak transfekte memeli hücre dizilerinden hızla oluşturulması ve yüksek geri kazanım doğal ER ve Golgi dolayımlı salgılama yolundan kanalize proteinleri ifade için etkili bir vasıta, bu bariyer ele alan ve bir. Burada, insan HEK293F ve yüksek protein verimine için tasarlanmış bir memeli ifade vektörü ile transfekte edilmiş HEK293S hücre çizgileri kullanılarak protein ifadesi için tek bir protokoldür. Bu sistemin uygulanabilirliği kültürünün litresi başına geri kazanılan saflaştırılmış proteinin 95-120 mg arasında verimleri ile eksprese üç temsilci glikoproteinleri kullanılarak araştınlır. Bu proteinler, insan FcyRIIIA ve sıçan α2-6 sıyalıltransferaz, ST6GalI, hem bir N-terminal GFP füzyon ifade, hem de rekombinant insan immünoglobülin Fc G1 bulunmaktadır. Bu sağlam sistem utiizotopik olarak zenginleştirilmiş proteinler ve kütle spektrometrisi, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi kullanılarak yapı çalışmaları için de karbonhidrat ekspresyonu için uyarlanabilir bir serumsuz ortam lizes. Ayrıca, N-glıkan bileşimi verimi azaltır olmayan bir şekilde belirli bir glıkan değişiklikleri önlemek için küçük bir molekül eklenerek ayarlanabilir.

Üst düzey protein ekspresyonu ve saflık Bu optimize edilmiş ifade sistemi glikosile proteinlerin yüksek verimle üretilen. Tipik bir desen IgG1-Fc (Şekil 1) ifadesi gösterilir. Bu durumda, gün 0, ham bir ortam içinde çözülebilen sentezleme fraksiyonu kullanılarak analiz edilir 5. günde protein ekspresyonu kadar Gün 1 (seyreltme) eklenmiştir transfeksiyon gün ve daha sonra, kültür gündür. K...

Watch this Scientific Journal Video about High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension at JoVE.com

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Biyoloji

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Toz numuneler mutlak Kuantum Verimi Ölçümü

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...