Name: quantitative analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos at JoVE.com

The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.

הצהרת אתיקה: כל העבודה מן החי, כולל בעלים, רבייה וקרבה אושרה על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי של מרכז סרטן קטרינג סלואן זיכרון ועדת שימוש (IACUC), פרוטוקול # 03-12-017. אוסף עובר 1. הערה: כל עבוד?...

<ol>
	<li>Saiz, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cell+fate+decisions+in+the+mouse+embryo.">Early cell fate decisions in the mouse embryo.</a> Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).</li><li>Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+a+blastocyst:+cell+behaviors+driving+cell+fate+choice+and+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo.">Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).</li><li>Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cells+get+together:+High-resolution+approaches+to+study+the+dynamics+of+early+mouse+development.">Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. , (2015).</li><li>Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Mu&#241;oz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+Efficient+2D/3D+Nuclear+Segmentation+Method+for+Analysis+of+Early+Mouse+Embryo+and+Stem+Cell+Image+Data.">A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).</li><li>Le Bin, G. C., Mu&#241;oz-Descalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct4+is+required+for+lineage+priming+in+the+developing+inner+cell+mass+of+the+mouse+blastocyst.">Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst.</a> Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).</li><li>Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Levels+Modulate+Primitive+Endoderm+Cell+Fate+Choice+and+Timing+in+the+Mouse+Blastocyst.">GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst.</a> Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).</li><li>Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneities+in+Nanog+Expression+Drive+Stable+Commitment+to+Pluripotency+in+the+Mouse+Blastocyst.">Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst.</a> Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).</li><li>Saiz, N., Kang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analyses+for+elucidating+mechanisms+of+cell+fate+commitment+in+the+mouse+blastocyst.">Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst.</a> Proceedings of SPIE. 9334, (2015).</li><li>Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+cell+allocation+to+trophectoderm+and+inner+cell+mass+in+the+mouse+blastocyst.">A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).</li><li>Dietrich, J. -. E., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+patterning+in+the+mouse+pre-implantation+embryo.">Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo.</a> Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).</li><li>Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sequential+cell+behaviours+direct+primitive+endoderm+formation+in+the+mouse+blastocyst.">Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst.</a> Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).</li><li>Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+Lrp2+pathway+members+reveals+progressive+epithelial+differentiation+of+primitive+endoderm+in+mouse+blastocyst.">Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).</li><li>Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Erk+signalling+promotes+ground+state+pluripotency+in+the+mouse+embryo.">Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo.</a> Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).</li><li>Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signal-dependent+segregation+of+primitive+endoderm+and+epiblast+in+the+mouse+blastocyst.">FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (5), 715-724 (2010).</li><li>Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+formation+of+the+first+two+distinct+cell+types+of+the+inner+cell+mass+in+the+mouse+embryo.">Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).</li><li>Artus, J., Panthier, J. -. J., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+PDGF+signaling+in+expansion+of+the+extra-embryonic+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst.">A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).</li><li>Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primitive+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst:+Sequential+transcription+factor+activation+and+regulation+of+differentiation+by+Sox17.">The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17.</a> Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).</li><li>Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse.">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li><li>Bessonnard, S., De Mot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata6,+Nanog+and+Erk+signaling+control+cell+fate+in+the+inner+cell+mass+through+a+tristable+regulatory+network.">Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network.</a> Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).</li><li>Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , (2014).</li><li>Czechanski, A., Byers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cell+lineage+specification+in+a+marsupial:+a+case+for+diverse+mechanisms+among+mammals.">Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals.</a> Development. 140, 965-975 (2013).</li><li>Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Fr&#246;din, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitotic+progression+and+preimplantation+lethality+in+mice+lacking+OMCG1,+a+new+evolutionarily+conserved+nuclear+protein.">Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein.</a> Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).</li><li>Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+protein+kinase+C+couples+cell+sorting+with+primitive+endoderm+maturation+in+the+mouse+blastocyst.">Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst.</a> Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).</li></ol>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבצע ניתוח כמותי של immunofluorescence כל הר על עוברי עכברים בשלב preimplantation. פרוטוקול immunofluorescence חזק 22 ואחריו ברזולוציה גבוהה, כל הר הדמית confocal ועל ידי פילוח תמונה באמצעות פיסת מחויטת של תוכנת 4. בעוד הבחירה של פרוטוקול immunofluorescence אינה קריט?...

עובר preimplantation העכבר הוא פרדיגמה ללמוד את הופעתה ותחזוקה של pluripotency in vivo, כמו גם מודל לחקר מפרט גורל תא דה נובו epithelialization ביונקים. שלבי preimplantation של פיתוח יונקים מוקדשים הקמת שלוש שושלות התאים שמרכיבים את הבלסטוציסט, כלומר epiblast פלוריפוטנטיים - אשר מוליד את רוב הרקמות סומטיים בתאים ניבט - ושתי שושלות extraembryonic, את trophectoderm (TE) ואת endoderm פרימיטיבי (PRE) (איור 1 א) 1,2. פרוטוקול זה מתאר את הנהלים (1) הקציר ולתקן עוברי עכברים בשלב preimplantation, (2) לבצע immunofluorescence לתייג חלבונים בעלי עניין, (3) לבצע כל הר הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם יכולות חתך-z ו- (4) לבצע פילוח הגרעין של תמונות confocal ומנתח תמונה כמותית שלאחר מכן. צינור זה מאפשר tהוא משוחד מדידת רמות החלבון בגין המחאת זהויות תא לאפיין תת-אוכלוסיות של תאים באתרו. פרוטוקול זה יכול להתבצע בתוך זמן קצר של 3 - 4 ימים עבור המלטה אחת (בדרך כלל עד 10 עוברי עכברים), מאוסף העובר בניתוח הנתונים (איור 1B). הניתוח סימולטני של המלטות כמה יגדיל את ניתוח ההדמיה ונתונים נטלו הזמן, ובכך להאריך את אורכו הכולל של פרוטוקול. עובר העכבר הבמה preimplantation הוא מערכת צייתנית באופן ניסיוני אשר, בהינתן גודלו הקטן וסטריאוטיפית מורפולוגיה 3, הוא גם מתאים בתחום הדמית טוטו של תהליכים תאיים עם רזולוצית תא בודד. כדי לבצע ניתוח משוחד, מערכות ברמה של מספר סטטיסטית הרלוונטי של עוברים, אוטומטית, צינור ניתוח כמוני רצוי. עם זאת, בשל צפיפות גרעיני גבוה של מסת התאים הפנימית (ICM) של הבלסטוציסט ( <stרונג&gt; האיור 1A, 2D), פלטפורמות פילוח תמונה מקובלת אינו מספק מספיק דיוק להקים זרימת עבודה אוטומטי או חצי אוטומטי. מצד שני, פילוח ידני, בעוד מדויק, אינו מאפשר העיבוד של קבוצות גדולות של תאי עוברים, וגם לא מתאים להגדרה לשחזור, משוחדת של זהויות תא - שהוא קריטי במיוחד כאשר לומד שלבי התפתחות, שהדפוסים של סמן ביטוי לא נפתר במלואה (למשל, אינה מציג חלוקה בינארית פני אוכלוסייה). פתחנו לאחרונה ומאומתים שיטת פילוח תמונה מותאמת בעוברי העכבר preimplantation ועבור תאי גזע עובריים בעכבר (ESCs) המשיג דיוק גבוה, תוך דורשי השקעת משתמש מינימאלי 4-8. צינור הניתוח שמובא כאן סובב סביב כלי הפילוח המבוסס תמונת MATLAB הפילוח הגרעיני האינטרקטיווי מודולרי (דקות) 4. MINS performs פילוח גרעיני ללא פיקוח על קבוצות גדולות של ערימות-Z confocal לאחר שמשתמש קימת מספר מינימאלי של מאפייני תמונה, באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI) (טבלה 1) 4. צינור זה הוכיח עצמו יעיל עבור דור של נתוני העברת נתונים גבוהים על ביטוי חלבון ולוקליזציה תא סוג שני בר, מטופלים בניסוי וגנטי עוברת משונה ESCs 5-7. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים את היישום של דקות עד פילוח תמונות העובר preimplantation הבמה. לדוגמאות של ביצועים MINS על ESCs עיין 4,7. הצעד פילוח גרעיני אוטומטי מפחית באופן משמעותי את נטל הזמן של תהליך זיהוי התא, ואילו מדידות עוצמת מרחבית הקרינה לאפשר קביעה משוחדת של זהויות התא לבין הדור של מפות תלת-ממדיות של תחומים ביטוי גנים בעמדה תא בעובר (איור 1C </strong&gt;). יתר על כן, את יכולת ההרחבה של זרימת העבודה זו עושה את זה החלות על הניתוח של המלטות פרט באמצעות קבוצות גדולות של עוברי מטופלים באופן ניסיוני, או עוברי של רקע גנטי שונה 5,6. MINS זמין באופן חופשי http://katlab-tools.org (התוכנה דורשת רישיון MATLAB). אין גישה שפותחה עד היום מאפשר הדור של נתונים מעמיקים כזה על ביטוי חלבון ולוקליזציה תא עוברי preimplantation העכבר. כל הניסיונות עד כה ב לכימות סוגים אלה של נתונים הוגבלו על נחישות quantitation ידני של מספרים סלולריים עבור אוכלוסיות שונות בעובר (או לגמרי באופן ידני, או תוכנה בסיוע) 9-19. הגישה זו (שילוב תוכנה דקה) כבר מותאמת ונבדקה על עוברי preimplantation עכבר ESCs; זאת ביצועיו על מערכות אחרות עם צפיפות גבוהה גרעינית, למרות עדיין נבדק, צפויים להיות שווה ערך.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1365">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Embryo collection</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:743px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blunt probe for plug checking</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgery scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pre-assembled aspirator tube &#38; mouthpiece</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longer rubber tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-178-2AA&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FHM</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-024-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-004-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well plates</td>
			<td>Nunc/Thermo-Fisher</td>
			<td>12-566-300&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunofluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well U-bottom plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-245-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDX2</td>
			<td>Biogenex</td>
			<td>AM392-5M</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GATA6</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1700</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GATA4</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9053</td>
			<td>1:100, 10 min fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GATA4</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-1237</td>
			<td>1:100, overnight fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOX17</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanog</td>
			<td>ReproCELL</td>
			<td>RCAB0002P-F</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT4</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>1:100, 10 min to overnight fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAB2</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD-610464</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Various</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm glass-bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Segmentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer running 64-bit Windows OS</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MATLAB (software)</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINS (software)</td>
			<td>Free</td>
			<td>n/a</td>
			<td>http://katlab-tools.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע כמוני, תא בודד באתרו מנתח של ביטוי חלבון ללמוד מפרט שושלת בעוברי preimplantation עכבר. הנהלים הדרושים אוסף העובר, immunofluorescence, הדמיה על מיקרוסקופ confocal, ופילוח תמונה וניתוח מתוארים. שיטה זו מאפשר לכמת את הביטוי של סמנים גרעיניים מרובים ואת מרחבית (XYZ) קואורדינטות של כל תאים בעובר. הוא מנצל MINS, כלי תוכנה פילוח תמונה שפותחו במיוחד עבור ניתוח של תמונות confocal של עוברים preimplantation ואת תאי גזע עובריים מושבות (ESC). MINS מבצעת פילוח גרעיני ללא פיקוח ברחבי ממדי X, Y ו- Z, ומייצרת מידע על מצבת תא בחלל תלת ממדים, כמו גם רמות קרינה גרעינית עבור כל ערוצים עם קלט משתמש מינימאלי. בעוד פרוטוקול זה בצורה מיטבית עבור הניתוח של תמונותשל עוברי עכברים בשלב preimplantation, זה יכול בקלות להיות מותאם הניתוח של כל דוגמאות אחרות מפגינות יחס אות לרעש טוב ואיפה צפיפות גרעינית גבוהה מציבה משוכה פילוח תמונה (לדוגמא., ניתוח ביטוי של תאי גזע עובריים (ESC מושבות), הבחנת תאים בתרבית, עוברים של מינים אחרים או בשלבים, וכו &#39;).

כדי להקל על נתונים לפרשנות מצגת, יש להיזהר שלא לפגוע בעוברים במהלך האיסוף והמניפולציה, כך שכל התאי ואת המיקום היחסי שלהם ניתן לנתח איור 2 א -. D מציגה דוגמאות של blastocysts השלם בשלבים שונים עם חלל מורחב. צריך לפגוע להתרחש, טיפול נוסף יש לנקוט בעת נ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos at JoVE.com

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...