Name: quantitative analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos at JoVE.com

The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.

倫理の声明：飼育、繁殖と犠牲を含むすべての動物の作業は、メモリアル・スロ​​ーンケタリングがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）、プロトコル番号03-12-017によって承認されました。 1.胚のコレクション注：すべての動物の作業は、制度や地方当局によって承認され、地元や制度の規則に適合されている必要がありま?...

<ol>
	<li>Saiz, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cell+fate+decisions+in+the+mouse+embryo.">Early cell fate decisions in the mouse embryo.</a> Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).</li><li>Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+a+blastocyst:+cell+behaviors+driving+cell+fate+choice+and+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo.">Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).</li><li>Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cells+get+together:+High-resolution+approaches+to+study+the+dynamics+of+early+mouse+development.">Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. , (2015).</li><li>Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Mu&#241;oz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+Efficient+2D/3D+Nuclear+Segmentation+Method+for+Analysis+of+Early+Mouse+Embryo+and+Stem+Cell+Image+Data.">A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).</li><li>Le Bin, G. C., Mu&#241;oz-Descalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct4+is+required+for+lineage+priming+in+the+developing+inner+cell+mass+of+the+mouse+blastocyst.">Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst.</a> Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).</li><li>Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Levels+Modulate+Primitive+Endoderm+Cell+Fate+Choice+and+Timing+in+the+Mouse+Blastocyst.">GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst.</a> Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).</li><li>Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneities+in+Nanog+Expression+Drive+Stable+Commitment+to+Pluripotency+in+the+Mouse+Blastocyst.">Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst.</a> Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).</li><li>Saiz, N., Kang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analyses+for+elucidating+mechanisms+of+cell+fate+commitment+in+the+mouse+blastocyst.">Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst.</a> Proceedings of SPIE. 9334, (2015).</li><li>Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+cell+allocation+to+trophectoderm+and+inner+cell+mass+in+the+mouse+blastocyst.">A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).</li><li>Dietrich, J. -. E., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+patterning+in+the+mouse+pre-implantation+embryo.">Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo.</a> Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).</li><li>Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sequential+cell+behaviours+direct+primitive+endoderm+formation+in+the+mouse+blastocyst.">Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst.</a> Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).</li><li>Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+Lrp2+pathway+members+reveals+progressive+epithelial+differentiation+of+primitive+endoderm+in+mouse+blastocyst.">Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).</li><li>Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Erk+signalling+promotes+ground+state+pluripotency+in+the+mouse+embryo.">Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo.</a> Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).</li><li>Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signal-dependent+segregation+of+primitive+endoderm+and+epiblast+in+the+mouse+blastocyst.">FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (5), 715-724 (2010).</li><li>Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+formation+of+the+first+two+distinct+cell+types+of+the+inner+cell+mass+in+the+mouse+embryo.">Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).</li><li>Artus, J., Panthier, J. -. J., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+PDGF+signaling+in+expansion+of+the+extra-embryonic+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst.">A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).</li><li>Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primitive+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst:+Sequential+transcription+factor+activation+and+regulation+of+differentiation+by+Sox17.">The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17.</a> Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).</li><li>Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse.">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li><li>Bessonnard, S., De Mot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata6,+Nanog+and+Erk+signaling+control+cell+fate+in+the+inner+cell+mass+through+a+tristable+regulatory+network.">Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network.</a> Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).</li><li>Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , (2014).</li><li>Czechanski, A., Byers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cell+lineage+specification+in+a+marsupial:+a+case+for+diverse+mechanisms+among+mammals.">Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals.</a> Development. 140, 965-975 (2013).</li><li>Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Fr&#246;din, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitotic+progression+and+preimplantation+lethality+in+mice+lacking+OMCG1,+a+new+evolutionarily+conserved+nuclear+protein.">Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein.</a> Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).</li><li>Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+protein+kinase+C+couples+cell+sorting+with+primitive+endoderm+maturation+in+the+mouse+blastocyst.">Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst.</a> Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).</li></ol>

現在のプロトコルは、着床前段階のマウス胚の全マウント免疫蛍光の定量的な分析を実行する方法について説明します。堅牢な免疫蛍光プロトコル22は、高解像度、ホールマウント共焦点イメージングによっておよびソフトウェア4の仕立て片を用いて画像分割が続いています。免疫蛍光プロトコルの選択は重要ではないが、我々は、高速で信頼性が高いことが、我々がテスト...

マウスの着床前胚は、細胞の運命の仕様および哺乳動物におけるデノボ上皮の研究のための出現とin vivoでの多能性の維持だけでなく、モデルを研究するためのパラダイムです。そして2胚体外系統、栄養外胚葉（TE）と - ほとんどの体細胞組織と生殖細胞を生じさせる - 哺乳類の発生の着床前段階は胚盤胞、すなわち多能性胚盤葉上層を構成する3つの細胞系統の確立に専念しています原始内胚葉（PRE）（ 図1A）1,2。このプロトコルは、（1）収穫に手順を説明し、着床前段階のマウス胚を固定し、（2）目的のタンパク質を標識するために免疫蛍光を行う、（3）のzセクショニング機能を備えた共焦点顕微鏡を用いて全マウントイメージングを行い、（4）共焦点画像とその後の定量的画像分析の核セグメンテーションを行います。このパイプラインは、トンを可能にします彼は、 その場での細胞の亜集団を特徴づけるために、セルIDの割り当てのためのタンパク質レベルの測定に公正。データ解析（ 図1B）に胚コレクションから、（一般的に10マウス胚まで）単一のごみのために4日-このプロトコルはわずか3で行うことができます。いくつかの同腹仔の同時分析は、このように、プロトコルの全体の長さを延長する、画像化およびデータ分析の時間負担を増加させます。 着床前段階のマウス胚は、その小さなサイズとステレオタイプの形態3与えられた、実験的に扱いやすいシステムであり、単一セルの解像度を持つ細胞プロセスのトト撮影に適しています。胚の統計学的に関連する多数の公平な、システムレベルの分析を行うために、自動化され、定量分析パイプラインが望ましいです。しかし、胚盤胞の内部細胞塊（ICM）（高核密度に起因<st栄&gt;図1A、図2D）、従来の画像分割プラットフォームは、自動化または半自動化されたワークフローを確立するために十分な精度が得られません。一方、マニュアルセグメンテーションは、正確な一方で、細胞や胚の大コホートの処理を許可していません。また、セルアイデンティティの再現性、公平な決意するのに適している - 発達段階を研究する際に特に重要であるマーカーのパターン式は完全に（ 例えば 、人口全体のバイナリディストリビューションを示さない）解決しません。最近開発され、最小限のユーザ入力4-8を必要としつつ、高精度を実現マウス着床前段階の胚およびマウス胚性幹細胞（ESC）に合わせた画像分割方法を検証しています。 ここで紹介する解析パイプラインは、MATLABベースの画像分割ツールモジュラー対話型原子力セグメンテーション（MINS）4を中心に展開。 MINS Pユーザは、グラフィカル・ユーザー・インターフェース（GUI）（ 表1）4 を使用して 、画像特性の最小数を確立した後、共焦点のZスタックの大きなバッチの教師なし核セグメンテーションをerforms。このパイプラインは、野生型、実験的に処理し、遺伝的に改変された胚とのESC 5-7の両方でタンパク質の発現および細胞局在化の高スループットデータの生成のために効率的であることが証明されました。現在のプロトコルでは、我々は、着床前段階の胚の画像のセグメンテーションにMINSのアプリケーションを記述します。 ESCの上MINS性能の例については4.7を参照してください。空間的な蛍光強度の測定は、セル識別情報の公正な決意胚（ 図中の遺伝子発現ドメイン及び細胞位置の三次元マップの生成を可能にする一方、自動化された核のセグメント化ステップが大きく、セル識別プロセスの時間の負担を軽減1C </strong&gt;）。また、このワークフローの拡張性は、実験的に処理された胚の大コホートを通じて個々リットルの分析、または異なる遺伝的背景5,6の胚にそれが適用になります。 MINSは（ソフトウェアは、MATLABのライセンスが必要）http://katlab-tools.orgで自由に利用可能です。 今日までに開発なしのアプローチは、マウスの着床前胚におけるタンパク質発現および細胞局在化に対するこのような綿密なデータの生成を可能にしません。すべての試みはこれまでに、これらのタイプのデータを定量化で9月19日 （いずれか完全に手動で、またはソフトウェアアシスト）胚における異なる集団のために細胞数のマニュアル決意および定量に制限されています。 （MINSソフトウェアを組み込んだ）このアプローチは、に合わせ、マウスの着床前胚およびESCの上でテストされています。それにもかかわらず、高核密度を有する他のシステムでは、その性能は、まだテストされていないが、同等であると予想されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1365">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Embryo collection</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:743px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blunt probe for plug checking</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgery scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pre-assembled aspirator tube &#38; mouthpiece</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longer rubber tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-178-2AA&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FHM</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-024-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-004-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well plates</td>
			<td>Nunc/Thermo-Fisher</td>
			<td>12-566-300&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunofluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well U-bottom plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-245-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDX2</td>
			<td>Biogenex</td>
			<td>AM392-5M</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GATA6</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1700</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GATA4</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9053</td>
			<td>1:100, 10 min fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GATA4</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-1237</td>
			<td>1:100, overnight fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOX17</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanog</td>
			<td>ReproCELL</td>
			<td>RCAB0002P-F</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT4</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>1:100, 10 min to overnight fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAB2</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD-610464</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Various</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm glass-bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Segmentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer running 64-bit Windows OS</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MATLAB (software)</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINS (software)</td>
			<td>Free</td>
			<td>n/a</td>
			<td>http://katlab-tools.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos

このプロトコルは、系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のインサイチュ分析で定量、単セルを実行するための方法を提供 マウスの着床前胚インチ胚コレクション、免疫蛍光、共焦点顕微鏡で画像化し、画像分割および分析のために必要な手順が記載されています。この方法は、複数の核マーカーの発現と空間胚内のすべてのセルの（XYZ）座標の定量を可能にします。それはMINS、特に着床前胚および胚性幹細胞（ESC）のコロニーの共焦点画像の解析のために開発された画像セグメンテーションのソフトウェアツールを利用しています。 MINSはX、YおよびZ次元を横切る教師なし核セグメンテーションを行い、最小限のユーザ入力で、すべてのチャンネルについて、三次元空間内のセルの位置情報、ならびに核蛍光レベルを生成します。このプロトコルは、画像の解析のために最適化されているが着床前段階のマウス胚の、容易に良好な信号対雑音比を示す任意の他のサンプルの分析に適合し、ここで、高核密度は、画像分割（ 例えば 、胚性幹細胞（ESCの発現解析に障害をもたらすことができます）コロニーを、培養物中の細胞を分化、他の種または段階の胚、 等 ）。

すべての細胞およびそれらの相対的な位置を分析することができるように、データの解釈とプレゼンテーションを容易にするために、ケアは、収集および操作中の胚を傷つけないように注意すべきである。図2A - 。Dは、拡張キャビティと異なる段階で無傷の胚盤胞の例を示しています。発生する損傷べき結果を分析し、解釈する際に、余分な注意が必要?...

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Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

マウス着床前胚幹細胞の誘導

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

全体のマウス胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出によって遺伝子発現をトレース

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

リネージュの赤芽球系前駆細胞に成体マウス線維芽細胞のリプログラミングを直接します。

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...