Name: loss- and gain-of-function approach to investigate early cell fate determinants in preimplantation mouse embryos
Uploaded: 2016-06-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos at JoVE.com

Les auteurs souhaitent également remercier le groupe du Dr Xiong à l&#39;Université des sciences de la santé en Géorgie pour la fabrication et le partage des constructions pour néogénine ADNc et shRNA vecteurs. Cette étude a été soutenue par des subventions du programme de base de recherche en sciences (2013R1A1A4A01012572) financé par la Fondation de la recherche coréenne et par une subvention de l&#39;Université Sahmyook de recherche.

NOTE: Toutes les procédures pour l&#39;élevage et soins des animaux ont été effectués selon les règlements de l&#39;Université IACUC Sahmyook, Séoul, Corée du Sud. 1. Superovulation, Elevage et isolement Oviducte <ol><li> Maintenir C57BL / 6 souris consanguines dans les conditions suivantes: 22 ± 3 ° C, ~ 60% d&#39;humidité, 12 h cycle lumière / obscurité, et de l&#39;eau et de la nourriture ad libitum. </li><li> Provoquer superovulation des souris femelles 3-5 semaines d&#39;âge par une injecti...

<ol>
	<li>Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+molecular+regulation+of+the+mouse+blastocyst.">Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst.</a> Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).</li><li>Sasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+trophectoderm+fate+specification+in+preimplantation+mouse+development.">Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development.</a> Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).</li><li>Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tead4+is+required+for+specification+of+trophectoderm+in+pre-implantation+mouse.">Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse.</a> Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).</li><li>Ovitt, C. E., Sch&#246;ler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+Oct-4+in+the+early+mouse+embryo.">The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo.</a> Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Oocyte+Microinjection,+Maturation+and+Ploidy+Assessment.">Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment.</a> J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).</li><li>Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+blastocyst+genes+that+are+down+regulated+by+double-stranded+RNA-mediated+knockdown+of+Oct-4+expression.">Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression.</a> Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).</li><li>Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithin+in+mouse+preimplantation+development:+Its+role+in+compaction.">Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction.</a> Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).</li><li>Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+DNA-Specific+Stain+Methyl+Green+in+the+Fluorescent+Labeling+of+Embryos.">Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos.</a> J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).</li><li>Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neogenin+as+a+receptor+for+early+cell+fate+determination+in+preimplantation+mouse+embryos.">Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos.</a> PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).</li></ol>

Dans le présent protocole, nous démontrons de nouvelles méthodes de microinjection du matériel génétique, soit l&#39;ADNc ou shRNA, dans les embryons 2-PN souris pour explorer le rôle de néogénine dans la différenciation cellulaire précoce au cours de l&#39;embryogenèse de la souris. La modification génétique des embryons préimplantatoires est une technique puissante dans la découverte des informations clés sur les mécanismes sous-jacents moléculaires pour, par exemple, la première détermination de ...

Préimplantatoire de développement embryonnaire peut être divisé en plusieurs étapes distinctes, à partir du stade d&#39;une cellule à la morula et blastocyste. Beaucoup de preuves suggère que la polarité et les indices de position jouent un rôle au début de la détermination du destin cellulaire dans le trophectoderme (TE) et la masse cellulaire interne (ICM). Cependant, la nature des indices, la façon dont ils sont transduits en signaux cellulaires et les contextes physiologiques dans lesquels ces signaux sont capables d&#39;initier la différenciation de la lignée cellulaire ne sont pas connues. Ces cellules différenciées sont ensuite soumis à la spécialisation, à commencer à prendre des structures caractéristiques et fonctions nécessaires à l&#39; embryon la formation et à la croissance du placenta 1-3. embryons de pré-implantation sont particulièrement favorables à la manipulation par injection directe de matériel génétique modifié comme siRNA ou l&#39;ADNc cible et peuvent donc être utilisés pour étudier des molécules cibles spécifiques. Il y a une compréhension croissante que génétiqueanalyse des embryons de vertébrés est essentielle pour faire progresser notre compréhension du développement embryonnaire 4. l&#39;introduction précise d&#39;un gène de type sauvage ou une forme mutante dans un embryon dans un contexte en temps opportun pour accomplir ou intensité forte perte de fonction du gène a grandement facilité l&#39;étude des gènes régulés par le développement. Et déficitaires gain de fonction par microinjection de matériel génétique dans des embryons non mammifères et mammifères début individuels est relativement simple en raison de leur grande taille et de grande réceptivité 5. La micro-injection est typiquement réalisée en utilisant des vecteurs non viraux. Un avantage particulier a été pris de la facilité d&#39;utilisation de vecteurs non viraux sur des vecteurs viraux et des transgènes. Un rapide ou déficitaire système d&#39;expression gain de fonction dans des embryons de souris a été développée qui nous permet de disséquer et de comprendre les fonctions des gènes en embryologie vertébré 6,7. Le marquage fluorescent des embryons serait grandement faciliter la sélection des microinjected ou génétiquement manipulées et les embryons en même temps , délivrer un moyen pour quantifier indirectement le niveau d&#39;ARNsi ou d&#39; ADNc microinjecté expression basée sur l&#39; intensité de fluorescence 8. Pour ce faire l&#39;étiquetage, l&#39;ADNc de la protéine fluorescente, la GFP ou RFP, sont co-injectées soit des constructions de fusion ou séparément. L&#39;intensité de fluorescence de la GFP ou RFP révèle l&#39;ampleur de l&#39;expression d&#39;ARNsi ou d&#39;ADN étranger à faire en sorte que déficitaire ou gain de fonction a été accomplie. Ici, nous présentons un protocole de micromanipulation pour la technique de la fonction déficitaire et le gain-of qui nous a permis d&#39;identifier néogénine comme un récepteur qui transmet des signaux extracellulaires importants dans la différenciation cellulaire précoce chez les embryons de souris préimplantatoire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1507">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">M16 medium,</td>
			<td style="width:519px;">Gibco BRL (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:232px;">M7292 LOT# 11A832</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Goat serum,&#160;</td>
			<td style="width:519px;">Dako (Glostrup, Denmark)</td>
			<td style="width:232px;">X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">PMSG</td>
			<td>Folligon, Intervet, Holland</td>
			<td style="width:232px;">G4877-1000IU LOT#SLBD0719V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Mineral olie</td>
			<td style="width:519px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:232px;">CG5-1VL LOT# SLBC6783V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin&#160;</td>
			<td style="width:519px;">(Intervet, Holland)</td>
			<td style="width:232px;">(invitrogen , 15596-026)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">SuperScript&#174; III Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:519px;">lifetechnologies</td>
			<td style="width:232px;">18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">PCR pre mixture</td>
			<td style="width:519px;">&#160;(Bioneer, Daejon, S. Korea)</td>
			<td style="width:232px;">GenDEPOT , A0224-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Agarose (molecular grade)</td>
			<td style="width:519px;">BioRad</td>
			<td style="width:232px;">161-3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td style="width:519px;">Affymetrix USA</td>
			<td style="width:232px;">19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">polyclonal rabbit anti-neogenin antibody</td>
			<td style="width:519px;">Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td style="width:232px;">SC-15337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A-11094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A-21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa Fluor&#174; 555 Phalloidin</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A34055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:519px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:232px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin</td>
			<td style="width:519px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:232px;">3720-RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:496px;">all plasmid constructs&#160;</td>
			<td style="width:519px;">Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA).</td>
			<td style="width:232px;"></td>
			<td>the present studies were kindly provided by&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Neon&#174;&#160; Transfection System</td>
			<td style="width:519px;">lifetech</td>
			<td style="width:232px;">MPK10096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Stereo Microscrope</td>
			<td style="width:519px;">Nikon</td>
			<td style="width:232px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Micromainpulation system with Nikon</td>
			<td style="width:519px;">Nikon</td>
			<td style="width:232px;">Narishige ONM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">MicroInjector</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">GASTIGHT #1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Holder</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">Narishige IM 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Microfoge</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">Narishige MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">grinder</td>
			<td style="width:519px;">Narishige</td>
			<td style="width:232px;">EG400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Puller</td>
			<td style="width:519px;">Sutter Instrumnet company</td>
			<td style="width:232px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:519px;">Thermo Scientific Forma</td>
			<td style="width:232px;">EW-39320-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Veriti&#174; 384-Well Thermal Cycler&#160;</td>
			<td style="width:519px;">lifetechnologies</td>
			<td style="width:232px;">4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss- and gain-of-function approach to investigate early cell fate determinants in preimplantation mouse embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

Nous avons découvert que néogénine est transitoirement exprimée au cours des premiers stades de développement des embryons préimplantatoire de souris, apparaissant dès au stade 2 cellules et durable jusqu&#39;au début du morula , mais devenir déficient à la fin morula et stades blastocyste (Figure 2A). En outre, la répartition spatiale des néogénine a été limitée principalement à l&#39;extérieur des cellules. Les résultats de l&#39; analyse par RT-PCR ...

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Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

L&#39;objectif de ce protocole est de décrire un déficitaire et d&#39;acquérir de-méthode de la fonction qui est applicable pour identifier néogénine comme un récepteur spécifique de stade qui mène à trophectoderme et la différenciation cellulaire interne de masse dans des embryons de souris préimplantatoire.

Déficitaires et approche Gain de fonction d&#39;enquêter sur les cellules précoce destin déterminants dans les embryons de souris préimplantatoire

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Méthodes de transfert localisé précisément de cellules ou de l&#39;ADN dans des embryons de souris après l&#39;implantation précoce

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Recherche

Biologie du développement

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Analyse quantitative de l&#39;expression des protéines pour l&#39;étude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire d&#39;embryons

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome profilage des<em&gt; In-Vivo</em&gt; embryons de bovins pré-implantation à l&#39;aide de deux couleurs Microarray Plate-forme

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Dérivation de lignées de cellules souches provenant d’embryons préimplantatoires souris

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Une nouvelle utilisation d’échographie en trois dimensions de haute fréquence pour la caractérisation de grossesse précoce chez la souris

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Analyse quantitative Immunofluorescence entier-montent des Populations de progéniteurs cardiaques chez des embryons de souris

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Une base RANKL Osteoclast Culture dosage de moelle osseuse de souris pour enquêter sur le rôle de mTORC1 dans la Formation des ostéoclastes

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Préparation de petites bibliothèques d’ARN pour le séquençage à partir d’embryons de souris précoces

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...