Name: loss- and gain-of-function approach to investigate early cell fate determinants in preimplantation mouse embryos
Uploaded: 2016-06-06T13:00:00
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著者らはまた、製造およびcDNAとのshRNAベクターをネオゲニンための構造を共有するためのジョージア健康科学大学の博士熊のグループを承認したいと思います。この研究は、韓国研究財団によっておよびSahmyook大学からの研究助成金によって賄わ基礎科学研究開発プログラム（2013R1A1A4A01012572）からの助成金によってサポートされていました。

注：動物の飼育や心配事のためのすべての手順はSahmyook大学、ソウル、韓国のIACUCの規則に従って行いました。 1.過排卵、繁殖や卵管の単離<ol><li> 22±3℃、〜60％の湿度、12時間の明/暗サイクル、水と食料を自由摂取：以下の条件の下で、近交系C57BL / 6マウスを維持します。 </li><li>誘導0.1ミリリットル/ヘッドで5 IU妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG）の腹腔内注射によって3-5週齢の雌マウス...

<ol>
	<li>Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+molecular+regulation+of+the+mouse+blastocyst.">Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst.</a> Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).</li><li>Sasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+trophectoderm+fate+specification+in+preimplantation+mouse+development.">Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development.</a> Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).</li><li>Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tead4+is+required+for+specification+of+trophectoderm+in+pre-implantation+mouse.">Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse.</a> Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).</li><li>Ovitt, C. E., Sch&#246;ler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+Oct-4+in+the+early+mouse+embryo.">The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo.</a> Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Oocyte+Microinjection,+Maturation+and+Ploidy+Assessment.">Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment.</a> J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).</li><li>Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+blastocyst+genes+that+are+down+regulated+by+double-stranded+RNA-mediated+knockdown+of+Oct-4+expression.">Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression.</a> Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).</li><li>Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithin+in+mouse+preimplantation+development:+Its+role+in+compaction.">Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction.</a> Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).</li><li>Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+DNA-Specific+Stain+Methyl+Green+in+the+Fluorescent+Labeling+of+Embryos.">Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos.</a> J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).</li><li>Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neogenin+as+a+receptor+for+early+cell+fate+determination+in+preimplantation+mouse+embryos.">Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos.</a> PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).</li></ol>

現在のプロトコルでは、我々は、マウスの胚発生の初期に細胞分化におけるネオゲニンの役割を探求する2-PNのマウス胚に、cDNAまたはshRNAのいずれかで、遺伝物質のマイクロインジェクションの新規な方法を示しています。着床前胚の遺伝子改変は、例えばのための基礎となる分子メカニズムに関する重要な情報を暴くための強力な技術は、最初の細胞系譜の決意です。遺伝子改変は、遺伝子...

着床前胚発生は、1細胞期から桑実胚および胚盤胞に、いくつかの別個の段階に分けることができます。多くの証拠は、極性および位置合図は栄養外胚葉（TE）および内部細胞塊（ICM）に初期の細胞運命の決意に役割を果たすことを示唆しています。しかしながら、それらはセルラ信号に導入されているかの手がかりの性質、および生理学的コンテキストとは、そのような信号は、知られていない細胞系譜の分化を開始することが可能です。これらの分化した細胞は、その後胎盤1-3の胚適切な形成と成長のために必要な特徴的な構造と機能を取るために始めて、専門を受けます。 着床前胚は、siRNAまたは標的cDNAのような修飾された遺伝物質の直接注射による操作に特に適しているので、特定の標的分子を研究するために利用することができます。その遺伝的成長の理解があります脊椎動物の胚の分析は、胚発生4の我々の理解を進めるために重要です。 gain-または機能喪失型遺伝子のを達成するためのタイムリーな文脈での胚への野生型遺伝子または変異形の正確な導入が大幅に発達調節される遺伝子の研究を容易にしました。 loss-がと機能獲得型遺伝物質の微量注入を介して、個々の早期非哺乳動物および哺乳動物の胚には、その大きなサイズと大きな受容5の比較的単純です。マイクロインジェクションは、典型的には、非ウイルスベクターを使用して実行されます。特定の利点は、ウイルスベクターおよびトランスジーン上に非ウイルスベクターを使用することの容易さからとられています。マウス胚の急速なloss-がまたは機能獲得型の発現系は、私たちは解剖し、脊椎動物の発生学6,7における遺伝子機能を理解することを可能にするように開発されました。 胚の蛍光標識が大きくMICRの選択を容易にしますoinjectedまたは遺伝的に胚を操作し、同時に、間接的に蛍光強度8に基づいて、マイクロインジェクションsiRNAまたはcDNAの発現レベルを定量化する手段を付与します。この標識、蛍光タンパク質のcDNAを達成するために、GFPまたはRFPは、別々に融合構築物またはいずれかと同時注入されます。 GFPまたはRFPの蛍光強度は、loss-がを保証または機能獲得なされたものに対するsiRNAまたは外来DNAの発現の程度を明らかにする。 ここで、我々は、私たちは、着床前のマウス胚における初期の細胞分化に重要な細胞外の手がかりを中継受容体としてネオゲニン同定することを可能にしたloss-が、ゲインオブファンクション技術のためのマイクロマニピュレーションプロトコルを提示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1507">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">M16 medium,</td>
			<td style="width:519px;">Gibco BRL (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:232px;">M7292 LOT# 11A832</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Goat serum,&#160;</td>
			<td style="width:519px;">Dako (Glostrup, Denmark)</td>
			<td style="width:232px;">X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">PMSG</td>
			<td>Folligon, Intervet, Holland</td>
			<td style="width:232px;">G4877-1000IU LOT#SLBD0719V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Mineral olie</td>
			<td style="width:519px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:232px;">CG5-1VL LOT# SLBC6783V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin&#160;</td>
			<td style="width:519px;">(Intervet, Holland)</td>
			<td style="width:232px;">(invitrogen , 15596-026)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">SuperScript&#174; III Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:519px;">lifetechnologies</td>
			<td style="width:232px;">18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">PCR pre mixture</td>
			<td style="width:519px;">&#160;(Bioneer, Daejon, S. Korea)</td>
			<td style="width:232px;">GenDEPOT , A0224-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Agarose (molecular grade)</td>
			<td style="width:519px;">BioRad</td>
			<td style="width:232px;">161-3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td style="width:519px;">Affymetrix USA</td>
			<td style="width:232px;">19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">polyclonal rabbit anti-neogenin antibody</td>
			<td style="width:519px;">Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td style="width:232px;">SC-15337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A-11094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A-21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa Fluor&#174; 555 Phalloidin</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A34055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:519px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:232px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin</td>
			<td style="width:519px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:232px;">3720-RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:496px;">all plasmid constructs&#160;</td>
			<td style="width:519px;">Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA).</td>
			<td style="width:232px;"></td>
			<td>the present studies were kindly provided by&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Neon&#174;&#160; Transfection System</td>
			<td style="width:519px;">lifetech</td>
			<td style="width:232px;">MPK10096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Stereo Microscrope</td>
			<td style="width:519px;">Nikon</td>
			<td style="width:232px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Micromainpulation system with Nikon</td>
			<td style="width:519px;">Nikon</td>
			<td style="width:232px;">Narishige ONM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">MicroInjector</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">GASTIGHT #1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Holder</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">Narishige IM 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Microfoge</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">Narishige MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">grinder</td>
			<td style="width:519px;">Narishige</td>
			<td style="width:232px;">EG400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Puller</td>
			<td style="width:519px;">Sutter Instrumnet company</td>
			<td style="width:232px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:519px;">Thermo Scientific Forma</td>
			<td style="width:232px;">EW-39320-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Veriti&#174; 384-Well Thermal Cycler&#160;</td>
			<td style="width:519px;">lifetechnologies</td>
			<td style="width:232px;">4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss- and gain-of-function approach to investigate early cell fate determinants in preimplantation mouse embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

我々は、早ければ2細胞期でとして登場すると永続的な初期の桑実胚までは、後期桑実胚と胚盤胞段階（ 図2A）で欠損となって、ネオゲニンが一過着床前マウス胚の初期発生段階で発現していることを発見しました。また、ネオゲニンの空間分布は、主に細胞外に制限しました。 RT-PCR分析の結果は、4細胞期でピークに達するが、完全に16細胞期に欠く以降...

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Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

このプロトコルの目的は、ロスオブを説明し、利得の栄養外胚葉と着床前マウス胚における内部細胞塊分化につながる段階特異的受容体としてネオゲニン識別に適用可能である関数法です。

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

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のトランスクリプトームプロファイリング<em&gt;生体内で</em二色マイクロアレイプラットフォームを使用&gt;産ウシ着床前の胚

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