Name: loss- and gain-of-function approach to investigate early cell fate determinants in preimplantation mouse embryos
Uploaded: 2016-06-06T13:00:00
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Os autores também gostaria de reconhecer o grupo do Dr. Xiong na Universidade de Ciências da Saúde da Geórgia para a fabricação e compartilhando as construções para neogenin vetores de cDNA e shRNA. Este estudo foi apoiado por bolsas do Programa Básico de pesquisa da ciência (2013R1A1A4A01012572) financiado pela Fundação coreana Investigação e por uma bolsa de investigação da Universidade Sahmyook.

NOTA: Todos os procedimentos para a criação e dos cuidados dos animais foram realizados de acordo com os regulamentos IACUC da Universidade Sahmyook, Seul, Coreia do Sul. 1. A superovulação, Reprodução e isolamento Oviduto <ol><li> Manter consanguíneos C57BL / 6 com as seguintes condições: 22 ± 3 ° C, ~ 60% de humidade, 12 h ciclo de luz / escuro, e água e comida ad libitum. </li><li> Induzir a superovulação de camundongos fêmeas de 3-5 semanas de idade, por uma injecção intraperitoneal de 5 I...

<ol>
	<li>Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+molecular+regulation+of+the+mouse+blastocyst.">Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst.</a> Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).</li><li>Sasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+trophectoderm+fate+specification+in+preimplantation+mouse+development.">Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development.</a> Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).</li><li>Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tead4+is+required+for+specification+of+trophectoderm+in+pre-implantation+mouse.">Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse.</a> Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).</li><li>Ovitt, C. E., Sch&#246;ler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+Oct-4+in+the+early+mouse+embryo.">The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo.</a> Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Oocyte+Microinjection,+Maturation+and+Ploidy+Assessment.">Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment.</a> J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).</li><li>Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+blastocyst+genes+that+are+down+regulated+by+double-stranded+RNA-mediated+knockdown+of+Oct-4+expression.">Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression.</a> Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).</li><li>Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithin+in+mouse+preimplantation+development:+Its+role+in+compaction.">Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction.</a> Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).</li><li>Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+DNA-Specific+Stain+Methyl+Green+in+the+Fluorescent+Labeling+of+Embryos.">Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos.</a> J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).</li><li>Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neogenin+as+a+receptor+for+early+cell+fate+determination+in+preimplantation+mouse+embryos.">Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos.</a> PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).</li></ol>

No presente protocolo, demonstramos novos métodos de microinjecção de materiais genéticos, quer cDNA ou shRNA, para os embriões de ratos de 2 PN para explorar o papel da neogenin na diferenciação celular precoce durante a embriogênese mouse. A modificação genética de embriões pré-implantação é uma técnica poderosa para a descoberta de informações importantes sobre os mecanismos subjacentes moleculares para, por exemplo, a primeira determinação linhagem celular. A modificação genética é um dos m?...

Preimplantation o desenvolvimento embrionário pode ser dividido em várias fases distintas, a partir do estádio de uma célula para a mórula e blastocisto. Muito evidência sugere que a polaridade e indicadores de posicionamento desempenhar um papel na determinação do destino da célula precoce no trofectoderma (TE) e a massa celular interna (ICM). No entanto, a natureza dos sinais, como eles são transduzidas em sinais celulares, e os contextos fisiológicos em que tais sinais são capazes de iniciar a diferenciação linhagem de células não são conhecidos. Estas células diferenciadas, em seguida, submetidos a especialização, começando a assumir estruturas características e funções necessárias para a formação de embriões adequada e crescimento da placenta 1-3. embriões pré-implantação são particularmente propício à manipulação por injecção directa de material genético modificados como siRNA ou de cDNA alvo e, portanto, pode ser utilizada para estudar moléculas alvo específicas. Há uma crescente compreensão de que genéticaA análise de embriões de vertebrados é fundamental para fazer avançar nossa compreensão do desenvolvimento embrionário 4. introdução exacta de um gene de tipo selvagem ou uma sua forma mutante em um embrião num contexto oportuna para realizar gain- ou perda de função do gene tem grandemente facilitado o estudo de genes regulados relativamente ao desenvolvimento. Deficitária e ganhar de função através de microinjecção de materiais genéticos em embriões não-mamíferos e mamíferos primeiros individuais é relativamente simples por causa de seu grande tamanho e grande receptividade 5. A microinjecção é tipicamente realizada usando vectores não virais. vantagem particular foi tomada em consideração a facilidade de utilização de vectores não virais mais de vetores virais e transgenes. A perda-rápido ou sistema de expressão de ganho de função em embriões de camundongos foi desenvolvida que nos permite dissecar e entender as funções dos genes na embriologia dos vertebrados 6,7. marcação fluorescente de embriões facilitaria enormemente a seleção de microinjected ou geneticamente manipulado embriões e, ao mesmo tempo conceder um meio para quantificar indirectamente o nível de expressão de ADNc ou siRNA microinjectados com base na intensidade de fluorescência 8. Para realizar esta rotulagem, ADNc de proteína fluorescente, GFP ou RFP, são co-injectados quer como construções de fusão ou separadamente. A intensidade da fluorescência da GFP ou RFP revela a extensão de expressão de siRNA ou DNA estranho para assegurar que deficitária ou ganho-de-função tem sido realizado. Aqui, apresentamos um protocolo de micromanipulação para a técnica função deficitária e ganho-de- que nos permitiu identificar neogenin como um receptor que transmite sinais extracelulares importantes na diferenciação celular no início de embriões de ratos pré-implantação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1507">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">M16 medium,</td>
			<td style="width:519px;">Gibco BRL (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:232px;">M7292 LOT# 11A832</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Goat serum,&#160;</td>
			<td style="width:519px;">Dako (Glostrup, Denmark)</td>
			<td style="width:232px;">X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">PMSG</td>
			<td>Folligon, Intervet, Holland</td>
			<td style="width:232px;">G4877-1000IU LOT#SLBD0719V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Mineral olie</td>
			<td style="width:519px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:232px;">CG5-1VL LOT# SLBC6783V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin&#160;</td>
			<td style="width:519px;">(Intervet, Holland)</td>
			<td style="width:232px;">(invitrogen , 15596-026)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">SuperScript&#174; III Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:519px;">lifetechnologies</td>
			<td style="width:232px;">18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">PCR pre mixture</td>
			<td style="width:519px;">&#160;(Bioneer, Daejon, S. Korea)</td>
			<td style="width:232px;">GenDEPOT , A0224-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Agarose (molecular grade)</td>
			<td style="width:519px;">BioRad</td>
			<td style="width:232px;">161-3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td style="width:519px;">Affymetrix USA</td>
			<td style="width:232px;">19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">polyclonal rabbit anti-neogenin antibody</td>
			<td style="width:519px;">Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td style="width:232px;">SC-15337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A-11094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A-21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa Fluor&#174; 555 Phalloidin</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A34055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:519px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:232px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin</td>
			<td style="width:519px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:232px;">3720-RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:496px;">all plasmid constructs&#160;</td>
			<td style="width:519px;">Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA).</td>
			<td style="width:232px;"></td>
			<td>the present studies were kindly provided by&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Neon&#174;&#160; Transfection System</td>
			<td style="width:519px;">lifetech</td>
			<td style="width:232px;">MPK10096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Stereo Microscrope</td>
			<td style="width:519px;">Nikon</td>
			<td style="width:232px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Micromainpulation system with Nikon</td>
			<td style="width:519px;">Nikon</td>
			<td style="width:232px;">Narishige ONM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">MicroInjector</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">GASTIGHT #1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Holder</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">Narishige IM 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Microfoge</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">Narishige MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">grinder</td>
			<td style="width:519px;">Narishige</td>
			<td style="width:232px;">EG400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Puller</td>
			<td style="width:519px;">Sutter Instrumnet company</td>
			<td style="width:232px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:519px;">Thermo Scientific Forma</td>
			<td style="width:232px;">EW-39320-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Veriti&#174; 384-Well Thermal Cycler&#160;</td>
			<td style="width:519px;">lifetechnologies</td>
			<td style="width:232px;">4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss- and gain-of-function approach to investigate early cell fate determinants in preimplantation mouse embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

Descobrimos que neogenin é transitoriamente expressa durante os primeiros estágios de desenvolvimento de embriões de ratos pré-implantação, aparecendo tão cedo quanto na fase 2-célula e duradoura até o início mórula mas tornar-se deficiente no final de mórula e estádios de blastocisto (Figura 2A). Além disso, a distribuição espacial da neogenin estava restrita principalmente para fora das células. Os resultados das análises de RT-PCR foram consistentes ...

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Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

O objetivo deste protocolo é para descrever um deficitária e ganhar-de método de função que é aplicável para identificar neogenin como um receptor específico de estágio que leva a trofectoderma e diferenciação massa celular interna de embriões de ratos pré-implantação.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Biologia do Desenvolvimento

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptoma Profiling de<em&gt; In-Vivo</em&gt; embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Um baseado em RANKL Osteoclast cultura ensaio de Mouse medula óssea para investigar o papel de mTORC1 na formação de Osteoclast

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...