Name: in vivo functional brain imaging approach based on bioluminescent calcium indicator gfp-aequorin
Uploaded: 2016-01-08T15:00:01
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin at JoVE.com

We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil R&#233;gional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.

1. Получение образцов <ol><li> Приготовление растворов и настроить <ol><li> Поддерживать все дрозофилы линии на 24 ° C по стандартной пищевой среде. Задняя и держать их при низкой плотности во флаконе для генерации стандартизированного размера и веса мух. <ol><li> Добавьте 10 девственных самок...

<ol>
	<li>Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+imaging:+fluorescence+or+bioluminescence,+which+to+choose.">In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose.</a> J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidized+coelenterazine,+the+active+group+in+the+photoprotein+aequorin.">Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+data+on+the+bioluminescent+protein,+aequorin.">Further data on the bioluminescent protein, aequorin.</a> J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).</li><li>Baubet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein-aequorin+as+bioluminescent+Ca2++reporters+at+the+single-cell+level.">Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).</li><li>Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biogenic+amine+and+a+neuropeptide+act+identically:+tyramine+signals+through+calcium+in+Drosophila+tubule+stellate+cells.">A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells.</a> Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).</li><li>Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+patterns+of+calcium+transients+during+neural+induction+in+Xenopus+laevis+embryos.">Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos.</a> J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).</li><li>Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Br&#251;let, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca2++signalling+in+the+brain+of+Drosophila.">In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2 (3), e275 (2007).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Ca2++stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons.">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., R&#233;al, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-stores+mediate+adaptation+in+axon+terminals+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+Drosophila.">Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 12, 105 (2011).</li><li>Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+and+cAMP/CNG+channels+independently+regulate+the+cholinergic+Ca2+-response+of+Drosophila+mushroom+body+neurons.">PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons.</a> eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).</li><li>Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functional+calcium+imaging+of+induced+or+spontaneous+activity+in+the+fly+brain+using+a+GFP-apoaequorin-based+bioluminescent+approach.">In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach.</a> BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).</li><li>Lima, S. Q., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+properties+of+recombinant+semisynthetic+aequorins+and+recombinant+fluorescein-conjugated+aequorin+for+measuring+cellular+calcium.">Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium.</a> Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).</li><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Fiala, A., Spall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+of+brain+activity+in+Drosophila+by+transgenic+cameleon+expression.">In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression.</a> Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Olfactory+Representations+in+the+Drosophila+Antennal+Lobe.">Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe.</a> Science. 303 (5656), 366-370 (2004).</li></ol>

Недавно разработанный биолюминесцентного основе GFP-экворин Представленный здесь подход позволяет в естественных условиях функциональной записи Ca 2+-активности в различных нейронов, а также, при желании, в другой вид клеток, таких как почки звездчатых клеток, как сообщается ?...

Основная рисунка и функции деятельности в головном мозге и его отдельных структур уже давно является областью интенсивного изучения в области неврологии. Возможно, некоторые из самых ранних успешных подходов, используемых для решения этого вопроса были прямыми физиологическое измерение изменения в электрической активности - однако альтернативные методы, которые позволяют жить визуализации изменений напряжения, рН или кальция концентрации (как прокси-сервер для деятельности) привели дополнительные возможности для изучение нейронной активности 1. Методы визуализации выполнять широкий спектр преимуществ, таких как снижение инвазивности и способности контролировать деятельность в целом структур головного мозга. Кроме того, в животных с послушными генетики в том числе плодовой мушки дрозофилы, развитие генетически кодируемых показателей кальция, таких как Cameleon, GCaMPs и других 1 позволили исследователям следить одиночные нейроны, нейронные популяции и весь мозгструктуры. В то время как более традиционные люминесцентные методы визуализации кальция с помощью GCaMPs (GFP, слитый с кальмодулина) или беспокоиться (CFP и YFP, слитый с кальмодулина) оказались полезные методы, обеспечивающие хорошее пространственное и временное разрешение, основной процесс светового возбуждения порождает некоторые ограничения на его экспериментальное Приложения. Из-за природы света возбуждения, флуоресценции, фото-отбеливания, и фототоксичности неизбежно производимого, которые, следовательно, ограничивает глубину структур, которые могут быть отображаемого, продолжительность записи, а также непрерывность реального времени записи. Другими словами, записи, часто должна быть выполнена с перерывами, чтобы избежать этих нежелательных побочных эффектов. Из-за этих проблем, были разработаны дополнительные альтернативные методы визуализации кальция. Одним из наиболее перспективных методов биолюминесцентного изображений, которая опирается на свете получаемой посредством ферментативной реакции после связывания кальция. Bioluminescenт изображения не требует света возбуждения и, следовательно, не испытывает те же трудности, как и обычные изображения кальция. Биолюминесцентного репортера акворина - изолирован от Aequorea Виктория, то же самое, из которого медузы GFP был также isolated- связывает кальций помощью трех ручных EF структур и проходит конформационное изменение, что приводит к окислению его кофактора коэлентеразином и выхода синего света (λ = 469 нм) 2,3. Акворина имеет очень низкое сродство к кальцию (K D = 10 мкм), что делает его идеальным для мониторинга переходных кальция, поскольку он производит очень мало шума и фонового не мешает системе буферизации внутриклеточного кальция 4. Хотя экворин ранее использовался для наблюдения за процессом индукции нервной в Xenopus яйца 5 свет производится слишком тусклый, чтобы использовать для реального времени визуализации нейронной активности. В целях решения этой проблемы, Филиппа Br &amp;# 251; пусть и коллеги в Институте Пастера создали генетическую конструкцию слияния GFP и экворин гены, имитируя естественное состояние в 4 медуз. Этот ген слитого продукта связывает кальций снова с помощью трех ручных EF структур акворина, которые претерпевает конформационное изменение, ведущий к окислению коэлентеразином, который передает энергию без радиационно к GFP. Эта передача энергии приводит к высвобождению зеленого света (λ = 509 нм) с GFP, а не синим светом от акворина. Слияние GFP и акворина также придает большую стабильность белка помогает слитого белка производят свет от 19 до 65 раз ярче, чем в одиночку экворин 4. Использование биолюминесцентного подход в головном мозге расширяется текущее экспериментальное использование визуализации кальция как с точки зрения длительности непрерывной записи и количества структур в головном мозге, которые могут быть записаны. В широком смысле в контексте предыдущей работы это означает, что как глобальные и большееРазнообразие регионализации &quot;деятельности&quot; мозга могут контролироваться (через прокси-сервер переходных кальция). Что еще более важно деятельность может контролироваться дольше, в режиме реального времени и постоянной основе, которые легко поддается погоне за полного понимания базисной функции в головном мозге. В последние несколько лет, наша лаборатория и другие разработали трансгенных мух, выражающие GFP-экворин под контролем двоичной системе экспрессии (GAL4 / UAS-GFP-экворин) 5,6. Мы использовали GFP-экворин биолюминесценции для записи активности при естественных раздражителей, таких как запах 7,8, а также изученных клеточных компонентов, модулирующих Ca 2+-активности в грибных тел следующих рецептора ацетилхолина стимуляции прямой никотиновой применения 9. Кроме того, мы также использовали GFP-экворин решить ряд экспериментальных вопросов, которые не смогли быть рассмотрены ранее, как долгосрочныеизображения спонтанных переходных кальция и визуализации глубоких структур головного мозга 10. Совсем недавно мы использовали систему / UAS GAL4 выразить млекопитающих рецептор АТФ Р2Х 2 11 катион канала, в проекционных нейронов (ПНС) и использовать систему Lexa, чтобы выразить GFP-экворин в грибных тел (MB247-Lexa, 13XLexAop2-ИВС-G5A-ВР) (любезность Б. Пфайффер, Janelia Farm, США). Это позволило нам активизировать ПН применением СПС, в свою очередь, активирует грибные тела (вниз по течению целевых ПНС), имитируя более естественные условия, такие как ответ на запах раздражитель. В целом этот метод объединения Р2Х 2 и GFP-экворин расширяет экспериментальные возможности. В широком смысле это дает возможность лучше понять закономерности деятельности мозга, инициируя новые исследования о том, как различные стимулы и возмущения могут изменять базальную паттерна активности.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1023911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL&#160;</td>
			<td>prolabo</td>
			<td>26 764.298</td>
			<td>normapur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>prolabo</td>
			<td>25 108.295</td>
			<td>normapur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzyl-coelenterazine</td>
			<td>Prolume, nanolight&#160;</td>
			<td>Cat #301 Coelenterazine h</td>
			<td>http://www.prolume.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dental glue</td>
			<td>3M ESPE&#8482;</td>
			<td>46954</td>
			<td>Protemp&#8482; IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon glue</td>
			<td>3M ESPE&#8482;</td>
			<td>36958</td>
			<td>Express&#8482; 2 Regular Body Quick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td>122s</td>
			<td>3M Scotch Magic Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>4868</td>
			<td>100-1000&#181;L Univesal Pipette Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chamber and holder (stage)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubation box</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (No 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Micro-dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td>Micro-dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glue applicator&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>5mm Depth 15&#176; stab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td>iXon (cooled to -80&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse-E800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20x Fluor .5w</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection microscope with fluorescence</td>
			<td>Leica MZ Fl III</td>
			<td>N/A</td>
			<td>leica dissection scope and florescent lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tight dark box</td>
			<td>Science Wares</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom built by Science Wares</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Minipuls 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>depends on thickness</td>
			<td>Tygon R3603, St-Gobain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0135 &#160;(VC-66CS)</td>
			<td>Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion regulators</td>
			<td>Leventon</td>
			<td>201108</td>
			<td>Dosi-flow 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>measurement and automation explorer</td>
			<td>Sciences Wares &#38; National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photon imager&#160;</td>
			<td>Science Wares &#38; National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photon viewer</td>
			<td>Science Wares &#38; National Instuments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software https://www.microsoft.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>virtual dub</td>
			<td>open access&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://virtualdub.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-GA2</td>
			<td>Martin et al., 2007, Ref. 1&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;No stocks {currently} publicly available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP&#160;&#160;</td>
			<td>B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.&#160;</td>
			<td>(STOCK #1117340)</td>
			<td>pfeifferb@janelia.hhmi.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2X2</td>
			<td>Lima and Misenboeck, Ref. 11&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;No stocks {currently} publicly available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OK107</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>854</td>
			<td>http://flystocks.bio.indiana.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo functional brain imaging approach based on bioluminescent calcium indicator gfp-aequorin

Функционал естественных изображений стала мощным подход к изучению функции и физиологию клеток головного мозга и структур, представляющих интерес. Недавно был разработан новый метод Ca 2+ -imaging помощью биолюминесценции репортер GFP-экворин (GA). Этот новый метод опирается на слияния GFP и экворин генов, производя молекулу, способную связываться кальций и - с добавлением его кофактора коэлентеразина - излучающих яркий свет, который можно наблюдать через фотонов коллектора. Трансгенные линии, несущие ген GFP в-экворин были получены для мышей и Drosophila. У Drosophila, ген GFP-экворин был помещен под контроль системы двоичной GAL4 / UAS позволяет направленной экспрессии и визуализации в головном мозге. Этот метод впоследствии было показано, чтобы быть способным обнаруживать и внутрь Ca 2+ -transients и Са 2+ -released от внутренних магазинов, Самое главное это позволяет в большей продолжительности в непрерывной записи изображений на больших глубинах в пределах мозга, и записи на высоких временным разрешением (до 8,3 мс). Здесь мы представляем основной метод для использования биолюминесцентного изображений для записи и анализа Ca 2+-активности в течение грибных тел, структуру центрального к обучению и памяти в летучей мозга.

Слияние GFP в акворина позволяет визуализировать нашу область интереса до биолюминесценции визуализации с помощью возбуждения GFP в люминесцентной режиме на микроскопе (3А, 4А, 6А, 6E). Один из самых простых способов, чтобы стимулировать грибовидные тела через активизацией ионотро...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin at JoVE.com

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

В Vivo Функциональное мозга изображений подход, основанный на Биолюминесцентный кальция Индикатор GFP-акворина

Здесь мы представляем роман Ca 2+ -imaging подход с использованием биолюминесцентного репортера. Этот подход использует конденсированную конструкт GFP-экворин, который связывается с Са 2+ и излучает свет, устраняя необходимость в возбуждении светом. Значительно этот метод позволяет длительной непрерывной визуализации, доступ к глубинных структур головного мозга и высоким временным разрешением.

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

The overall goal of bioluminescent imaging is to image in vivo functional calcium transient, a proxy for activity, for longer periods, and in deep brain structures. This method can help answer key questions in the field of neurobiology, such as what the basal activity of the fly brain looks like during sleep. The main advantage of this technique is that it does not require excitation using your laser.This allows one to image calcium transient deeper into the tissue, and for a longer period of time without the photobleaching and toxicity, versus classical calcium imaging. This method can provide insight into the basal brain activity in drosophila, and can also be used with other model organisms, such as the mouse. To begin, prepare the drosophila melanogaster line of interest, and the experimental solutions, as described in the accompanying text protocol.Then, ice anesthetize a single drosophila by transferring it to a glass vial on ice for two minutes. Next, move the fly to a chilled petri dish, and use a pair of forceps to gently place the fly inside a 1000 microliter pipette tip, trimmed so that the tip is at an angle of approximately 35 degrees. Using a brush, gently push and align each fly so that the head is completely past the edge of the tip, and the dorsal region is partially exposed.Then, apply prepared dental glue from the head to the pipette tip edge. Take extra care to avoid the crown of the head. Gluing of the head is critical because securing it in the correct position is essential for successful dissection and imaging.Additionally, poor gluing will lead to leakage of the ringer solution and death of the sample prior to imaging. Next, place the pipette tip, with the attached fly, through the hole in the recording chamber, and gently press to secure it into place. Then use a prepared silicon glue to secure the flat side of the chamber where it meets the pipette tip in order to prevent any leaks.Affix a piece of tap over the profusion channel, the short edge, and extending to the back of the chamber. Next, place the chamber with the fly under the microscope and turn on the fluorescent lamp. Then, pipette one milliliter of ringer solution into the chamber.Using a fine surgical knife, Make parallel incisions from the back of the fly's head to the antenal region on both sides. Then, cut along the edge of the eye, and make a perpendicular incision above the antenna that connects the previous incisions. Make a final incision at the back of the head, and then use a pair of fine, sharp forceps to remove the cuticle.Gently grasp and clear away any exposed respiratory tissue until the brain and the fluorescing mushroom body are clearly visualized. Next, use ultra-sharp forceps to carefully grasp and pinch the neural epithelia tissue covering the brain to remove it an allow for permeation of the coelenterazine. Using a pipette, wash the tissue twice with one milliliter of ringer solution to remove any debris left over from the dissection, and then place the sample into a dark box.Next, pipette one milliliter of ringer solution, containing five micromolar benzyl-coelenterazine into the chamber. Close the box and incubate the sample at room temperature for a minimum of two hours. Begin by turning on the microscope in the computer.Also, cool the camera to negative 80 degrees Celsius. Next, set up the drainage system and adjust the environmental controls to 20 degrees Celsius. Next, open the photon imager, create a new folder, and name the first recording.Then, set up the profusion system by adding the potassium-chloride, nicotine, and ringer solution to their respective reservoirs. Adjust the flow so that each solution discharges at two milliliters per minute. Next, place the sample onto the mount under the microscope, and adjust the magnification to 5X.Then, insert the profusion tube into the channel through the puncture. Set the microscope to fluorescent mode, and then center and bring the mushroom bodies into focus. Once the mushroom bodies are in focus, change the magnification to 20X.Recenter the image and adjust the focus. Next, position the drainage apparatus over the drainage pool and adjust the height of the drainage shunt, so that the tip is just above the drainage pool. Then, flush the sample with ringer solution for 30 seconds to check for adequate drainage.Finally, pull down the shield to seal off the apparatus from any outside light. Using the automated system in the photon imager program, make fine adjustments to the focus, and take a reference fluorescent image of the mushroom bodies. Adjust the photon speed to the desired recording speed, which should be anywhere from one image every 50 milliseconds up to one every second, or more.Then, select photon mode, and open the shutter. Next, enter the genotype, sex, age, and sample number in the log entries. Adjust the position of the region of interest boxes over the calyx, the cell bodies, and the medial lobes, by clicking on the boxes and dragging them into position while holding control.Now, record baseline values for about five to 10 minutes. Next, flip on the switch to begin the flow of nicotine. At the same time, press enter and add a note to signify the flow of nicotine has begun.After one minute, stop the flow, and make another note in the log signifying that the flow has been stopped. Then, wash the sample with ringer solution for five minutes. While the sample recovers, turn off the wash, set the timer for an additional five minutes, and prepare to start the flow of potassium-chloride.When ready to begin, start the flow of potassium-chloride, and enter 100 millimolar potassium-chloride start"into the sample log. After one minute, stop the flow, and enter potassium-chloride shut off"into the sample log. Then, wash the sample with ringer solution for one minute and switch the microscope to fluorescent mode.Take a final fluorescent image, and then turn off the ringer solution and remove the sample. In the analysis program, open the first file, select the display control"tab, and click on ROI. Then, hold control and select a region of interest.Next, adjust the size, the orientation, and shape of the ROIs to encompass the GFP illuminated calyx and cell bodies, and the medial lobes. Once all the regions of interest have been added, select the movie"tab to play the photon video. Adjust the second width and second steps as desired.Then readjust the ROI placement as necessary, so it remains within the active regions in the video. Select some representative screenshots of the GFP fluorescence, the nicotine response, and the potassium-chloride response. Then crop the screenshots and paste the representative images into a presentation slide for late analysis and comparison.Adjust both the second width and second step to the recording speed in seconds. Also, select the length of the analysis by moving the gray markers in the top panel to the bracketed region, before the stimulus initiation, and just after the response end. Next, select suspend views"while playing, and then press the rewind button to reset the video playback to the beginning, followed by the play button.Then, select the tab count rate chart"in order to adjust the units and also adjust the color of the regions of interest, as well as the line colors as desired. When the analysis is finished, select export count rate data. Then, select the combined recordings of the calyx and cell bodies, as well as those from the medial lobe regions on each side and paste those images into a slide with the response images.One of the simplest ways to stimulate the mushroom bodies is through activation of the ionotropic nicotinic acetylcholine receptors. The typical response to 25 micromolar nicotine, shown here, commences with the fast activation of both the calyx and cell bodies, and the medial lobes, and uses the fused GFP-aequorin construct, which binds to calcium and emits light. Generally, the response in the calyx and cell bodies lasts longer, and exhibits a greater bioluminescent response than the lobes, as shown in the sequential panels of the response.A sample recording of the bioluminescent response to nicotinic activation over time is described by this graph, where the number of photons in the region of interest containing the calyx and cell bodies is graphed in black, and the number of photons within the medial lobe region are shown in red. From this graph, the length of the response, the peak photon value during the response, and the total area under each curve can all be determined. Once mastered, the preparation phase should take only two hours prior to incubation, depending on the number of flies.In addition, each recording can be completed in as little as twenty minutes, if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to properly age and keep fly stock to ensure reproducability among samples. Following this procedure, further behavioral tests can be performed in order to answer additional questions, like what affect the activity of the structure has on specific behavior.The development of this technique has paved the way for researchers in the field of neurobiology to explore long-term neural activity in the drosophila brain. After watching this video, you should have a good understanding of how to prepare samples for bioluminescent imaging in the fly brain. Don't forget that nicotine can be hazardous to your health.Precautions such as gloves should be taken when preparing solutions or cleaning up from this procedure.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Функциональной визуализации кальция в развивающихся Корковая сетей

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Одновременное электрофизиологические записи и Кальций изображений супрахиазматического ядра нейронов

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Кальция изображений для визуализации мозга ответы на эндокринных сигнализации в дрозофилы

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

В естественных условиях кальция изображений боковой линии клетки волос в личиночной данио рерио

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Кальций Изображения в мыши Нижняя Оливковая

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

 &#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

μTongue: функциональная платформа визуализации на основе микрофлюидики для языка in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Кальций и гемодинамическая визуализация перицитов головного мозга у трансгенных мышей In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Стереотаксическая вирусная инъекция и имплантация линз с градиентным индексом для глубокой визуализации кальция in vivo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...